This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

אנו מתארים את השימוש של מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע היווצרות ניצן איבר בעובר האפרוח. טכניקה זו יש מספר שלבים קריטיים. בעקבות ניסויים ראשוניים, מצאנו כי המחסומים בצורת הציר בשימוש 9, 10 להישאר במקום בעובר הרבה יותר טוב מאשר מחסומים ישר. הצד השטוח הדיסטלי של המכשול מקלות על קרום vitelline ושומר המכשול במקום (איור 2 ג &#39;). הכנה קפדנית של מחסומים בצורת ציר מרדיד אלומיניום כמתואר בשלב פרוטוקול 1.6 חיונית להצלחת הניתוח. צעד חשוב שני הוא להבטיח כי ביצים הם לא עזבו מתוך האינקובטור במשך זמן רב מדי לאחר חלונאית, וביום לפני ההפעלה על העובר. מניסיוננו, עובר לשרוד פעולה טוב יותר אם הם ליד או טמפרטורת דגירה כאשר הניתוח מבוצע. תפעול ולכן צריך להתבצע במהירות האפשרית ואת הביצים resealed הפקודהly כדי להבטיח שיעורי הישרדות טובים. חוקרים רבים מוסיפים טיפת אנטיביוטיקה לעובר הבאים המיקרו-כירורגיה לפני שחזר את הביצים באינקובטור. הנוכחות של הנוזל מנעה את המחסומים יידבק גם בעמדה. תוספת של אנטיביוטיקה יכולה גם לסלק חרוזים לאחר מיקום. לכן לא באמצעות אנטיביוטיקה, פעולות מהירות וניקיון טוב עם מכשירים מומלצים להימנע מהידבקות. ניגוב מכשירים עם אתנול 70% לאחר כל שלב של מבצע חיוני כדי למנוע מכשירים מלהפוך דביק ממגע עם קרום vitelline אשר יכול לגרום הן מחסומים או חרוזים לדבוק מלקחיים (ראה פרוטוקול צעד 3.1.2.2). זנים שני חרוזים בשימוש עלול ליפול מחוץ למקום לאחר הניתוח. כאשר עמד מחסום נבדק למחרת לא ניתן היה לראות מבעד למחסום כדי לברר אם החרוז נשאר במקום או לא. במקרים בם החרוז הסתכסך תולדת ניצן כנף לא חולץ ( <stרונג&gt; טבלה 1). הימנעות העברת נוזלי עם החרוז כאשר להשתיל אותם כלומר חרוזים מקלים יותר בקלות על פן החתך של LPM (ראו פרוטוקול 2.3.2.3). לבסוף להבטיח כי עוברים קבועים מיד לאחר הקציר הוא קריטי ניתוח ביטוי גנים לאחר מכן טוב (ראה שלב פרוטוקול 4.2). פרוטוקול זה משנה ניסויים שפורסמו בעבר כי השתמשו מחסומים כדי למנוע ייזום ניצן איבר, מגדיר רוחב אופטימלי ספציפי מחסומים ומציג מיקום מכשול חרוז שילוב ואחריו ניתוח ביטוי גנים. מצאנו באמצעות רדיד אלומיניום קונבנציונלי, שהוא זול וזמין בכל המעבדות, מגיע לתוצאות שווות לאלה שהשתמשו בעבר רדיד טנטלום. רדיד ניתן להשאיר את העובר בעת ביצוע הכלאה באתרו (איור 2 ג &#39;) אבל אנחנו בדרך כלל להסיר אותו אם יש יותר העובר אחת מעובדת כדי למנוע קצוות חדים של רדיד נזק עוברי. Pמחקרי Ilot הוכיחו כי הרוחב של מחסומים באזור ההרגל חשוב במיוחד. בתחילה המחסומים trialed היו קצרים מדי תולדת ניצן רגל לא נמנעה. 1.2-1.3 מ&quot;מ הוא הרוחב האופטימלי עבור מחסום לחסום תולדת ניצן רגל לחלוטין. מחסומי הזרוע הצרים ביותר שאפשר למקם במדויק כדי למנוע תוצאת ניצן לתת שיעורי ההישרדות הטובים ביותר. זה יכול להיות צר ככל 0.5-0.7 מ&quot;מ. עם זאת, חסמים הם קצת רחבים יותר יש סיכוי גבוהים יותר לגרום חסימה מוחלטת של תולדת ניצן כנף משום שהם מאפשרים דיוק קטן של מיקום (השתמשנו 0.7-1 מ&quot;מ). הימנעות של כלי דם בעת ביצוע החתך היא קריטית עבור מחסומי רמת ניצן כנף. מחסומים חדיר למחצה שימשו בעבר כדי לחצות את ניצן איבר חומוס. MacCabe ופארקר, 1976 Summerbell 1979 הוא בשימוש מסננים 0.45 מיקרומטר ו 0.8 מיקרומטר גודל נקבובי, בהתאמה 16, 17. הם דיווחו כי אותות diffusible יכולים לעבור דרך הנקבובית מסנן וכיתוצאות מתבצעות באמצעות מחסומים חדירים למחצה היו באמצע דרך בין ניצן אבר ללא מכשול נוכחי ואחד עם מחסום רדיד טנטלום בלתי חדיר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש מחסומים חדירים למחצה של גודל נקבובי שונה כדי להבחין בין אותות מועמד על בסיס גודל או לשנות את הדינמיקה של דיפוזיה אות. פרוטוקול זה יש מגבלות שונות הקשורות בעיקר עם אורגניזם המודל עצמו. טכניקות אלו יכולים לשמש כדי לחקור שאלות נוספות בפיתוח איבר וגם שאלות אחרות של עובר החולייתנים. תנאים מיוחדים הוא שהאיבר / השטח מדובר יש לפתח כאשר עוברים האפרוח נגיש התערבות. הנוכחות של כלי הדם הגדולים באזור שבו מחסום צריך להיות ממוקם עושה מיקום המכשול יאוחר בשלב 13 או 14 מאתגר מבחינה טכנית. אם כלי דם גדולים נחתכים במהלך השמת המחסום הזה יכול לגרום לתמותה עוברת. הבדיקות שערכו לגבי כאשר שעתוק גורמי Tbx5 ו Tbx4 הם מושרה הראשון LPM היה מוגבל על ידי השלב המוקדם שבו נוכל למקם מחסום יגיע בסופו ההפך גם באגף או ניצן רגל בהתאמה. זה עשוי להיות מאלף כדי לנסות לחסום אינדוקציה גן Tbx בשלבים מוקדמים יותר, קרוב יותר gastrulation. המוקדם מחסום יכול להיות ממוקם באזור הכנף המשוער היה בהצלחת שלב 8 ובשלב הרגל באזור 10. פרוטוקול זה הוא כנראה לא מתאים ללימוד ביטוי גנים מעבר בשלבי ניצן איבר בגלל צמיחה מהירה שלאחר מכן תחליף את המחסום ותוצאות יתייחס רק העמדה הראשונית של המכשול. לאחר הקשורים במגבלות של עובר החומוס בהקשר זה, יתרונות על אורגניזמים מודל חוליות אחרים הם רבים. העובר החומוס הוא מודל חיה מאוד מתאים לסוג זה של התערבות פיזית בעובר חוליות. העוברים הם יחסית גדולים והם נגישים בקלות throuGH קליפת הביצה. אפשר לחזור העובר לניסויים נוספים (למשל, הסרת חרוז 18 או אפילו מחסום) או כדי לבדוק את ההתקדמות על ידי הסרת חלון הקלטת. יש היקף ניתן לכלול הדמיה לחיות או הדמיה זמן לשגות. אנו מתארים שיטה של ​​חלונאית ביצי תרנגולת כי הוא מתאים במיוחד פועלים בעוברים בראשית התפתחותם. במקרה של מחקרי איבר חשוב מאוד ומועיל כי קיים איבר מלא נגדי עבור כל ניסוי, המהווה נקודת בקרה פנימית אידיאלית עבור כל לשכפל ביולוגי. השילוב של שימוש מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע תוצאת איבר וחרוזים טבול מולקולות איתות לא דווח בעבר. הניתוח שלנו של ביטוי mRNA לאחר התערבויות כאלה הוא גם רומן. טכניקות אלו אפשרו לנו לנתח את הבעיה הקשה של מתי שעתוק איבר ספציפי גורמי Tbx5 ו Tbx4 הם המושרה LPM וגםלהראות כי מאוחר יותר, לפני אחר ענף חניכת ניצן, בנוכחות גני Tbx אלה LPM אינה מספיק עבור הפעלת שעתוק Fgf10 ואת תחילת תולדת ניצן איבר. דמויות 2G, 2D and 2E להמחיש הממצאים האלה היטב. עדר ביטוי Tbx4 בעקבות החדרת מחסום בשלב 10 ב 2G האיור הוא בניגוד מוחלט נוכחותה 2D ו 2E הבא החדיר מחסום בשלב 15, לאחר הגיוס של Tbx4. השתלת חרוזים ספוג RA הקל הצלת ייזום ניצן איבר בעקבות החדרת מחסום וכך נקודות כדי RA מן somites להיות חיוני LPM לפני תולדה ניצן איבר יכול להתחיל. שיטות אלו יכולים לשמש כדי לפתור שאלות נוספות בפיתוח איבר אלא גם שאלות אחרות של עובר החולייתנים. אזורים במוח, העין וגו צפויים להיות מתאים.

embryologists הקלסית בטכניקות גופניות באופן מסורתי לחקור את מנגנוני שליטת התפתחות עוברית. ב -1960 ו -1970 חוקרים פיתחו טכניקות שהשתמשו מחסומים בלתי חדירים מוכנס בין רקמות של העובר המתפתח כדי להדגים את החשיבות של אותות אינדוקטיבי במהלך embryogenesis. האינטרס שלנו הוא בפיתוח איבר חוליות ובמיוחד אילו אירועים מקדימים תולדת ניצן איבר. לדוגמא, החדרת מחסום יכולה למנוע תולדת ניצן איבר ההתרחשות בצד אחד של עובר אפרוח אך מאפשר לה להמשיך בדרך כלל בצד הנגדי, unoperated. חומרים המשמשים לייצור מחסומים אלו השתנו; למשל, צלחות נציץ 1 טנטלום רדיד 2. מחסומים אלה מפרידים את המזודרם צלחת לרוחב ביעילות (LPM), שממנו צורות ניצן איבר, מן somites התגבשה מתוך mesoderm הפרקסיאלית. טכניקות השתלת כירורגים להוכיח כי שנינות קשר הדוקותh את somites חיוני אם ייזום ניצן איבר הוא להתרחש LPM 3 4. בשנות ה -80 וה -90 ביולוגים התפתחותיים גילו diffusible מולקולות איתות כי הם חיוניים בשליטה תהליכים התפתחותיים. חרוזים ספוגים מולקולות איתות אלה יכולים להיות מושתלים באזורים הספציפיים של העובר ולייצר שינויי התפתחות עוברית. לדוגמא, חומצה רטינואית (RA) נלקחת על ידי חרוזי חילוף יונים הוא שוחרר על פני תקופה של 24 שעות כאשר מושתלים לתוך עובר אפרוח והוא יכול לייצר שכפול תמונת ראי של הספרות 5. חרוזי אקרילי הפרין המכילים חלבון FGF יכולים ליזום תולדת ניצן איבר מן interlimb LPM 6. לאחרונה גנטיקת עכבר והדגים לקחה את מחקר חניכת איבר חוליות לעידן חדש (הנסקרת ב 7). ישנן ראיות טובות כי נוכח RA ב somites לפני תחילת ניצן איבר היא האות diffusible החיונית הנדרשת על ידי LPM ליזום ניצני איבר. רצינו לנצל את הנגישות ואת החוסן ניסיוני של עובר החומוס לנתח את שפעת ההשתלה מחסום על ביטוי גני LPM בערך בזמן חניכת ניצן איבר. עיבוד לרומן של השיטה שלנו הוא לשלב מחסום אותות בלוקים מרקמות ציריות עם לרוחב הזרקה אל מחסום גורמי אנדוגניים מועמד אספקת אקסוגני שנחסמו על ידי הגדר. הפרוטוקולים הבאים הם אלו שפותחו כדי להקניט את מנגנוני אינדוקציה ניצן איבר וייזום. לימוד ייזום איבר ניצן אומר שימוש בעוברים בראשית התפתחותם. ביצי תרנגולת חלון חוקרים רבות על ידי הסרה הראשונה חלק אלבומין דרך צק האוויר עם מחט מזרק. עובר, השוכן על גבי החלמון, אז תשקר נמוך בתוך הביצה. זהו יתרון עבור חלק מטכניקות, כגון electroporation, אבל יכולים להיות חסרון אם מניפולציה כירורגית של העובר היא רצויה.אנו מוצאים שיש העובר קרוב הפתח ביצה ככל האפשר מהווה יתרון. שאלות להישאר לגבי אותות השולטים אינדוקציה ניצן איבר חוליות וייזום ואת הפרוטוקולים הבאים מתאימים לטפל בהם. אנחנו הראשונים לפתח פרוטוקול ההחדרה של מחסומים כדי למנוע תוצאת ניצן איבר חומוס בשלב מוקדם יותר מאשר בשלב 12 8. הגירסות מותאמות של פרוטוקולים אלה יכולים לשמש גם כדי לענות על שאלות אחרות על מוצאם והעיתוי של רמזים אינדוקטיביים שבו רקמת התרמה נגישה סמוכה אל primordium להיות מושרה. בתנאי באזור של העובר נגיש בשלב ההתפתחותי הרלוונטי, אז מחסום יכול להיות ממוקם בין שתי רקמות והשינויים סוגרים בפיתוח למדו. דוגמאות ניתן למצוא בהתפתחות המוח, הארכת ציר ואולי פיתוח איברים כגון אינדוקציה בכבד או בכליות.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

העובר החומוס מספק מודל חוליות מעולה שיכול לשמש כדי לנתח שאלות התפתחותיות בצורה ישירה. הנגישות ואת החוסן שלה לאחר התערבות כירורגית הם עוצמות ניסיוני מפתח. צלחות נציץ היו המחסומים הראשונים השתמשו כדי למנוע התחלת ניצן איבר חומוס 1. פרוטוקולים המשתמשים רדיד אלומיניום כמו מחסום בלתי חדיר כדי ניצן זרוע או אינדוקצית ניצן רגל או חניכה מתוארות. אנו משלבים את הטכניקה הזו עם לרוחב הזרקה אל המחסום אקסוגני גורמי אנדוגניים מועמד אספקה ​​שנחסמו על ידי הגדר. התוצאות מנותחות באמצעות הכלאה באתרו של ביטוי גנים לאחר מכן. ההתמקדות העיקרית שלנו היא על עצמו את התפקיד של איתות החומצה הרטינואית אינדוקציה וייזום מאוחר יותר של פני השטח העובר חומוס hindlimb. אנו משתמשים BMS 493 (אגוניסט ההופכי של קולטני חומצה רטינואית (RAR)) חרוזים ספוגים המושתל mesoderm הצלחת לרוחב (LPM) לחקות את ההשפעה ברהפרייה ממוקם בין somites (מקור של חומצה רטינואית (RA)) ואת LPM שממנו ניצנים איבר לגדול. גרסאות מותאמות של פרוטוקולים אלה יכולים לשמש גם כדי לענות על שאלות אחרות על מוצאם והעיתוי של רמזים אינדוקטיביים. בתנאי באזור של עובר החומוס נגיש בשלב ההתפתחותי הרלוונטי, מחסום יכול להיות ממוקם בין שתי רקמות והשינויים סוגרים בפיתוח למדו. דוגמאות ניתן למצוא את הסיומת המוח המתפתח, ציר בפיתוח איברים, כגון אינדוקציה בכבד או בכליות.

הפרוטוקול המפורט לעיל מתאר את השיטות הננקטות ואח Nishimoto. , 2015. המחקר בוחן אינדוקצית ניצן איבר וייזום הוא מלפנים hindlimb של עובר החומוס. תוצאות בעקבות החדרת מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע את התולדה של ניצן forelimb פורסמו 1 בעבר, 2, 9 אך חלו רק מחסומים באחד מחקרים מתארים מניעת ייזום ניצן רגל 1. נתוני Hindlimb מאל et Nishimoto. , מוצגים כאן כתוצאות נציג 2015 על בדיקת ביטוי mRNA לאחר החדרת מכשול. הביטוי Tbx4 ב LPM אינו מספיק כדי ליזום Hindlimb תולדה: דמויות 2B ו- C (טבלה 2) להראות כי החדרת מחסום בשלב 15 (איור 2 א) (ראה פרוטוקול 3.2) מוביל הן Fgf10ביטוי Fgf8 נעדר באזור ניצן הרגל (כונה על ידי סוגר) בצד ימין פעל. השוואה עם הצד השמאלי unoperated. עם זאת, הביטוי Tbx4 הוא ציין בשני שלב 19 ושלב 23 בצד המופעל (איור 2 ד ו E). אנו מסיקים כי הביטוי Tbx4 לבדו אינו מספיק כדי ליזום תולדה hindlimb מן LPM. מחקרים אחרים האפרוח הראו כי ביטוי גני Tbx מספיק כדי ליזום ניצן forelimb היווצרות 12, 13. איור 2 ג &#39;כלול כדי להמחיש כיצד מחסום נראה המוטבעת באזור הרגל של קיבעון פוסט העובר. ברוב המכריע של המקרים המחסומים הוסרו לפני הכלאה באתרו (פרוטוקול 4.3). RA מן somites חיונית LPM לפני Fgf10 גורם לימב באד Outgrowth: איור 3 א הוא סכימטי המייצג תוספת של דיסטלי חרוז ספוג RA כדי מחסום מוכנס בשלב 15 (פרוטוקול 3.2.1.3). לאחר תולדה המבצע איבר ניצן זה (מסומן בכוכבית) הוא ציין בצד ימין פעלו Tbx4, Fgf10 ו Fgf8 באים לידי ביטוי ניצן כפי שהם נמצאים בצד יצא משליטת (איור 3B, C ו- D, טבלה 2) . לכן תוספת של RA אל LPM מתגברת על השפעת תמורת ייזום ניצן המחסום ובשלמות גופם. אנו מסיקים כי ב- RA התפתחות נורמלית מן somites חיונית LPM לפני תולדה ניצן איבר יכול להיות יזם. ניצני hindlimb וכתוצאה מכך הם בדרך כלל קטנים יותר מאלה בצד השליטה. זה יכול להיות בגלל מינון RA ב LPM להיות לא שווה את מצב הסוג הבר. אם מינון RA מדי גבוה Apical Ectodermal רידג &#39;(AER) יכול להתקצר וניצנים קטנים יביאו14, 15. כדי לאשר RA (מתוך somites) ב LPM נדרש ייזום ניצן איבר רגיל אגוניסט ההופכי של RAR, BMS 493, היה בשימוש. חרוזים הם מושתלים לתוך LPM באזור הרגל בשלב 15 (ראה פרוטוקול 3.2.1.4) (3E איור). ביטוי Fgf10 הוא downregulated היישום הבא של BMS 493 חרוזי LPM, וכתוצאה מכך ניצני hindlimb קטנים יותר בהשוואה בצד הביקורת (האיור 3F; טבלה 3). חרוזים בקרה DMSO לא לגרום למומים אלה (איורים 3G ו 3H; טבלה 3). הפגמים שנצפו בעקבות יישום BMS 493 הם מתונים יותר מאלה המושרים על ידי פעולת מחסום; כלומר, Fgf10 עדיין הביע וניצני איבר נוצרים. זה עשוי להיות בגלל ההשפעות של BMS 493 מוגבלים מקומית סביב חרוזים לא יוכלו להרגיז כל RA המיוצר על ידי AXIרקמות al. מוקדם איתותי Axial ציינו את תאי LPM כי מאוחר יותר מהיר, Tbx4: בדקנו כאשר LPM רוכש יכולתה להביע Tbx4 באזור הפוטנציאלי יוצרי הרגל. השלב המוקדם בו מחסום יכול להיות מוכנס כי לאחר מכן יחסום תולדת ניצן רגל, הוא שלב 10. אנחנו הראשונים לפתח פרוטוקול להכניס מחסומים בשלבים מוקדמים יותר בשלב 12. מחסומים המוכנסים בין mesoderm הפרקסיאלית והרגל המשוערת LPM בשלב 10 (ראה פרוטוקול 3.4) היווצרות ניצן לחסום רגל ואת הביטוי של Tbx4 ב יוצרי רגל LPM (איורי 2F ו 2G, טבלה 2), דבר המצביע על כך אות מרקמות ציריות בשלב 10 נדרשת עבור ביטוי מאוחר יותר של Tbx4 ב LPM hindlimb. שקול את התוצאה הזאת עם 2D הדמוי ו- E שבו כניסת מחסום מאוחר יותר מאפשרת ביטוי Tbx4שיוקם. יתר על כן, בדקנו אם האות צירית זה יכול להיות RA על ידי התבוננות אם אגוניסט ההופכי של RAR מפחית ביטוי Tbx4. אגל BMS 493 להציב LPM hindlimb בשלב 10 (ראה פרוטוקול 3.4.1.3) downregulates ביטוי Tbx4 (איורים 2H ו 2I), ואילו חרוזים מלאה טבול DMSO לא משפיעים על ביטוי Tbx4 (2J דמויות 2K). יחד, תוצאות אלו תומכות מודל אות RA מרקמות ציריות מסדיר אינדוקצית איבר ידי ויסות Tbx4 באופן חיובי hindlimb LPM 7. מוות לאחר ניתוח: לוחות 1, 2 ו -3 מעבירים את הפרטים של תוצאות הניסוי כולל מספר העוברים גוזל מת פוסט תפעול לפני הקטיף. כמה מקרי מוות יש לצפות לאחר מיקרוכירורגיה מסוג זה. יכולים להישמר גוססי המספרים<html> עד למינימום על ידי וודא כי מכשירים הם נקיים, חור הביצה הוא חייב את הגודל המינימאלי, כי עובר נותרים ללא הגנה על חותם הסרט הדביק במשך זמן מינימאלי, בשיתוף עם הנקודה אחרונה זו שהפעולה מתבצע מהר ככל האפשר. אף אחד פעילויות אלו הינן מאוד זמן רב אך פעולות מעורבים חרוזים ומחסומים לקחת קצת יותר זמן. על אף האמצעים הללו, פעולות שבוצעו בשלבים המוקדמים ואלה באזור הכנף נוטים יותר לגרום למוות. ישנם כלי דם גדולים ברחבי להרכיב אזורי הגפה קרע בשוגג של כולים אלה עלולים להוביל למוות כתוצאה מאיבוד דם. אנו מוצאים כי ביצים נפתחו בשלב 8 או 9, אשר עובר לא נותח, לעתים קרובות למות על ידי למחרת. לכן, הפתרון היחיד לבעיות אלה הוא לבצע מספר גבוה של ניסויים. ד / 54,618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. מרקר ג&#39;ין שינויי ביטוי הבא מכשול או בהכנסת חרוז בשעה משוערת רגל הרמה. (א) סכמטי המציג מחסום עמדה (קו ירוק) ברמת רגל המשוערת (somites 26-32) בעובר בשלב 15. (B - E ו- G) ניתוח מאחל עובר פעל. אזור הרגל מתואר (בסוגריים). (ב) ביטוי Fgf10 נעדר LPM פעל, אך ביטוי חזק מזוהה באיבו השמאל. (ג) הביטוי Fgf8 התאור בצד המופעל, דבר המצביע אין AER. (ג &#39;) אותו העובר לפני המכשול הוסר. (ד) Tbx4 מתבטא LPM באותה רמה rostro- הזנב כמו ניצן שליטה. (E) ביטוי Tbx4 נשמר באזור רגל ימין למרות היעדר צמיחה איבר. (F) תרשים סכמטי של שלב<html> 10 עוברים אפרוח המוצגת מיקום מכשול (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת. (G) ביטוי Tbx4 נעדר פעל התקין LPM (הסוגר). (H) סכמטי בתרשים של עובר אפרוח שלב 10 מראה BMS 493 עמדת חרוז (עיגול סגול) ברמת הרגל המשוערת. (I) ביטוי Tbx4 הוא downregulated בצד ימין המופעלים בעקבות טיפול עם BMS 493. (J) תרשים סכמטי של עובר חומוס שלב 10 המוצגת מיקום חרוז מלא DMSO (עיגול אפור). (K) Tbx4 מתבטא בצד ימין פעל ברמה דומה לזו של אגף שמאל שפעה לאחר טיפול עם DMSO לבד. נתון זה יש הבדל בין 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ד / 54,618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; מציל איור 3. RA ההיעדרות של לימב באד נגרמת על ידי מכשול הכנסה והוא חיוני LPM לפני Leg באד התולדה. (א) תרשים סכמטי המציין עמד מחסום (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת (somites 26-32) וכן חרוז RA-ספוג (עיגול אדום). (B - D) RA מציל תולדת ניצן רגל (שמוצג על ידי כוכבית). (ב) ביטוי Tbx4 שוהה ניצן הרגל הציל דומה בצד un המופעל. (C) Fgf10 מתבטא הרגל הציל ניצן דומה בצד המופעלים האו&quot;ם. (ד) Fgf8 מתבטא AER של ניצן רגל ימין הציל. (E) סכמטי המציין היכן חרוזי 493 BMS (עיגולים סגולים) הונחו LPM הרגל המשוער של שלב 15 עובר. (F) ביטוי Fgf10 הוא downregulated בצד ימין המופעלים ואת ניצן הרגל הוא הבא הקטן BMS 49טיפול 3. חרוזים הם asterisked. (G) סכמטי בדומה (E), המציין את המיקום של חרוזי DMSO מלאים (עיגולים אפורים). (H) חרוזים DMSO (שמוצג על ידי כוכביות) לא משפיעים על ביטוי Fgf10 או גודל ניצן הרגל. נתון זה יש הבדל בין 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מחסום שלב להציב (חרוז +) * </td><td> פעל מספר </td><td> אגף חסר ** </td><td> אגף הנוכחי ** </td><td> מת מספר </td></tr><tr><td> שלב 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> שלב 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> שלב 12-13 (חרוז FGF4) </td><td> 41 </td><td> 7 (חסר חרוז) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> שלב 12-13 (חרוז ע&quot;ר) </td><td> 75 </td><td> 9 (חסר חרוז) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> שלב 13 (חרוז שליטה) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * מחסומי רדיד 0.7-1 מ&quot;מ ממוקמים בין somites 15-20 ואת mesoderm הצלחת לרוחב. 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חרוז FGF4. 0.05-0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חרוז RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> חרוז מלא DMSO. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** צ&#39;יק עוברים קבועים בשלבים 21-23 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. גדר תוצאות ניסוי ביד רמת כנף. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מחסום שלב להציב (חרוז +) * </<html> td&gt; <td> פעל מספר </td><td> רגל חסר ** </td><td> רגל הנוכחי ** </td><td> מת מספר </td></tr><tr><td> שלב 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> שלב 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> שלב 15 (חרוז FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> שלב 15 (חרוז ע&quot;ר) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * מחסומי רדיד 0.7-1.3 מ&quot;מ ממוקמים בין somites 26-32 ואת mesoderm הצלחת לרוחב. 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חרוז FGF4. 0.05-0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חרוז RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** צ&#39;יק עוברים קבועים בשלבים 18-24 </td></tr></tbody></table> טבלת 2. גדר תוצאות ניסוי ביד רמת רגל. <table bor</html style=";text-align:right;direction:rtl">דר = &quot;1&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot; FO: keep-עם-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td> פעל מספר </td><td> Leg ניצן קטן </td><td> Leg ניצן מעט קטן </td><td> Leg ניצן בגודל רגיל </td><td> מת מספר </td></tr><tr><td> BMS 493 חרוזים * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> חרוזי DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 חרוזים ספוגים 5 מ&quot;ג / מיליליטר BMS 493 להציב LPM בימין במה 14-15 ברמת רגל. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 חרוזי ספוגת DMSO להציב לבד בשלב 15 LPM התקין ברמת רגל. </td></tr><tr><td colspan="5"> עובר צ&#39;יק קבוע בשלבים 17-19. </td></tr></tbody></table> לוח 3. רגל רמת BMS 493 חרוז ניסוי תוצאות.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Video: Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Neuroscience

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ'יק

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מותאם באופן מיטבי

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ'יק

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

תא יחיד transfection בעוברים צ'יק

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial