Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

O sangue periférico de doadores saudáveis ​​do sexo masculino foi obtido com o consentimento informado e aprovação do Comitê de Bioética do Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 1. Isolamento e Activação de células humanas T CD4 + Naive <ol><li> Recolhe 2 ml de sangue periférico obtido a partir de dadores humanos saudáveis ​​por meio do consentimento informado e dilui-se com 2 ml de PBS estéril com EDTA (1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Adicionar lentamente o sangue diluído em cima de 3 mL de solução de sacarose com 1,077 densidade como anteriormente descrito 8. Nota: a migração durante a centrifugação diferencial provocada por diferenças na densidade fará com que os eritrócitos sedimentar completamente e uma camada de células mononucleares menos densas irão formar acima. 2 ml de sangue periférico irá processar cerca de 0,5 X 10 6 células T CD4 + naive após a purificatiem etapas. </li><li> Centrifugar 30 min a 250 xg a 21 ° C (rotor utilização para tubos de fundo redondo com ângulo fixo de 30 mm), sem ruptura para gerar o gradiente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Após centrifugação, o PBMC pode ser claramente observado como um anel branco. Recolher as PBMC com uma pipeta e transferir para tubo estéril para lavar roupa. </li><li> Após três lavagens com solução de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min para efectuar a purificação de células T CD4 + naive. métodos de triagem ou vários tipos de kits de purificação estão disponíveis para esta finalidade. De preferência, utilizar&gt; 1 x 10 7 PBMC para a purificação. <ol><li> Purifica-se células T CD4 + naive por selecção negativa com esferas magnéticas. Efectuar a selecção negativa com anticorpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A). Avaliar a porcentagem de pureza, determinando células CD4 + CD45RA + através de fbaixo citometria. Nota: Opcionalmente, proceder a incubação de PBMC durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 com uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em 10 ml de meio de cultura suplementado para promover a aderência de monócitos e continuar com a purificação de células CD4 + T naive. A recuperação eficiente de células T CD4 + naive a partir de sangue periférico depende em grande parte do sistema de purificação. </li></ol></li><li> Prepare a placas de 24 cavidades de cultura de células por adição de 250 ul por poço de PBS com anticorpo 5 ug / ml de anti-CD3 monoclonal e incubar durante pelo menos 2 horas a 37 ° C. Nota: As placas com 96 poços pode ser usado quando um número menor de células T CD4 + naive são utilizados (por exemplo, 2 x 10 4 x 10 -1 5). </li><li> Remover o anticorpo anti CD3 diluição do bem ou 24 placas de 96 poços e lava-se as placas duas vezes com PBS estéril 1x. </li><li> Dilui-se as células T CD4 + naive com&gt; 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em avançado meio RPMI 1640 suplementado com 3% de soro fetal de bovino (ou RPMI suplementado com 10% de soro), glutamina 2 mM e antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina). Nota: Se for necessário localização gangliósido em PBMCs, seguem o mesmo protocolo para a diluição e de estimulação, como descrito abaixo. </li><li> Adicionar 500 ul da diluição de células a poços revestidos com anti-CD3 e a poços não revestidos (células de controlo) na placa de 24 poços. Alternativamente, adicionar 100 ul da diluição de células para os poços da placa de 96 poços. </li><li> Conclua as condições de estimulação de células T CD4 + naive em anti CD3 poços revestidos por adição de 1 ug / ml de anticorpo anti CD28. </li><li> Manter as restantes células T CD4 + como de controlo nos poços não-revestidos sem adição de anticorpos anti-CD28. Incubar o repouso e activados de células CD4 + T para 0-72 horas, sob condições padrão de 37 °C e 5% de CO 2. </li><li> Para verificar uma activação adequada avaliar por citometria de fluxo da expressão do CD69 de activação precoce marcador (16 horas pós-activação) ou CD25 marcador de activação tardia (48 h pós-activação) em repouso e activados células ingénuas CD4 + T incubado a 37 ° C e 5% de CO2, na ausência ou na presença de anticorpos anti-CD3 / CD28 9,10. </li></ol> 2. A adesão de repouso e activados células naive CD4 + T <ol><li> Esterilizar 12 mm lamínulas redondas por autoclavagem e exposição à luz UV durante pelo menos 15 min. </li><li> lamelas lugar em placas de cultura celular de 24 poços estéreis. Nota: Para as culturas com menos de 1 x 10 5 células, é preferível utilizar câmaras de deslizamento com pequenas cavidades adaptadas para impedir a dispersão de células da lamela. </li><li> lamelas de revestimento (ou câmara de slides) com 200 ul de poli-L-lisina (PM de 150-300 kDa) 0,1% (w / v) de solução e incubar durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar e seco durante pelo menos 1 h à TA. </li><li> Misturar cuidadosamente e recolher o repouso e de células T CD4 + naive activados a partir das placas de 24 poços. Contar as células e se necessário, ajustar com meio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células para as lamelas revestidas com poli-L-lisina. Incubam-se as células por um período mínimo de 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Recolha e Fixação de repouso e activados células naive CD4 + T <ol><li> Remova cuidadosamente o meio de descanso culta e células T CD4 + naïve ativadas. </li><li> Adicionar 500 ul de PBS estéril RT lentamente. Nota: adição cuidadosa e remoção de soluções a partir de poços impede o desprendimento de células a partir da lamela. </li><li> Descartar o PBS e adicionar mais 500 mL PBS para remover completamente os meios de cultura. </li><li> Fixar as células por adição de 500 ul filtrada paraformaldeído a 4% (FILTração remove micropartículas que podem interferir com a análise de microscopia) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (de preferência) ou durante a noite a 4 ° C. Atenção: O paraformaldeído é um composto tóxico e volátil. Ele é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Use com cuidado e com um protocolo de segurança adequado. </li><li> Remover o fixador e lava-se, pelo menos, duas vezes com PBS à temperatura ambiente. </li><li> Avance para o próximo passo ou manter os poços da placa com 500 ul de PBS a 4 ° C durante vários dias até que a coloração. Nota: A esterilidade durante este processo ajuda a evitar o crescimento de microorganismos. </li></ol> 4. Coloração, Montagem e visualização por microscopia confocal <ol><li> Remover o PBS dos poços. Adicionar 500 ul de tampão de bloqueio a frio (1x PBS, 0,5% de albumina de soro de bovino de grau padrão, 1% de soro fetal de bovino a pH 7,4). Incubar durante 20 min em gelo. </li><li> Retire o tampão de bloqueio com cuidado e adicionar os anticorpos primários (anti gangliósidos GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),Conjugado com PE anti-CD25 e APC conjugada anti TCR e isotipos controlos diluídos em tampão de bloqueio a 2,5 ug / ml. </li><li> Incubar 2 hr em gelo ou durante a noite a 4 ° C. Nota: agitação orbital lenta é preferível. </li><li> Remover o anticorpo cuidadosamente e lentamente adicionar 500 ul de PBS. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar os anticorpos secundários (conjugado com FITC anti IgG3 para R24 anti GD3, Alexa Fluor 488 conjugado com Alexa Fluor 647 ou conjugado anti-IgG2a para anti GD2 14G2a) diluído em tampão de bloqueio a 0,1 ug / ml. </li><li> Incubar durante 1 hora em gelo no escuro, sem tremer. </li><li> Lavar três vezes em PBS como descrito em 4.4). Manter os poços com PBS suficiente para evitar a desidratação de amostras. </li><li> Adicionar Hoechst 333258 mancha diluída em PBS a 0,1 ug / ml. </li><li> Incubar 15 minutos à temperatura ambiente e remover. Lavar três vezes em PBS. </li><li> Colocar as lâminas numa toalha de papel e adicionar 20 ul de solução de montagem (50% de glicerol em PBS) ou solução de montagem comercials para evitar o desbotamento e extinguindo a partir de amostras. </li><li> Com cuidado, pegue a lamela com uma pinça fina e colocá-lo na solução de montagem. Assegurar que o lado da lamela em que as células estão ligados é, em contacto com a solução. Selar as lamelas com unha polonês e analisar usando fluorescência ou microscopia confocal. </li></ol> 5. Isolamento de ARN <ol><li> Prepare anticorpo CD3 anti (5 ug / ml) revestidas placas de 96 poços. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + naive / poço em 100 ul de meio de cultura suplementado com anticorpo CD28 anti (1 ug / ml) para completar o estímulo. Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 durante 0-72 horas. </li><li> Após diferentes tempos de pós-activação colocar as células para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 500 ul de PBS e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente Trizol. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e manter a amostra a -8076; C durante pelo menos 24 h. Prosseguir com o isolamento do RNA quando necessário. Nota: Partindo da amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 horas melhora o rendimento de ARN. Além disso, o uso de luvas de mão é essencial para evitar a degradação do ARN por RNases. </li><li> Descongelar a amostra por incubação a 37 ° C durante 2 minutos num banho de água. </li><li> Adicionar 200 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente à mão durante 30 segundos (para evitar a mistura agressiva de RNA em vórtice). Incubar 5 min à TA. </li><li> Centrifugar 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Recuperar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Adicionar 500 uL de isopropanol e inverter o tubo três vezes. </li><li> Incubar 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugação durante 10 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante por inversão. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol arrefecido em gelo a 75% e centrifugar 10 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Completamente descartar o sobrenadante e o sedimento de ARN secar, deixando a tampa do tubo aberto. NãoE: Neste ponto o sedimento não é claramente visível. Continuar mesmo assim. </li><li> Ressuspender o sedimento em 20 mL de água de grau molecular. Calcula-se a concentração e pureza dos ácidos nucleicos medindo a 260 nm e 280 nm de absorvância utilizando NanoDrop. </li><li> Proceder com cuidado para síntese de ADNc utilizando o kit da transcriptase reversa qualquer convencional e seguindo o protocolo MANUFACTURER&#39;S. Nota: Aproximadamente 0,5-2 ug de ARN é obtido a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + naive. ADNc pode ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN e utilizados em reacções de PCR em tempo real sem a necessidade de jogos de entrada de ARN de baixo. </li></ol>

<ol>
	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSOM+/+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+/+CD3+Mediated+T-Cell+Activation.">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498 (2013).</li><li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation.">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li><li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+the+brain:+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development,+stability,+disease,+and+regeneration.">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li><li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Mu&#241;oz, M. E., L&#242;pez-Guerrero, D. V., Mart&#236;nez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+na&#239;ve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters.">Activation of human na&#239;ve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li><li>M&#252;thing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids.">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A.">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li><li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation,+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection.">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li><li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients.">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li><li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex.">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li><li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming:+implications+for+quality+control.">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li><li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(GD3+synthase)+gene+in+human+cancer+cell+lines:+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes.">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li><li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo descrito pode ser usado para localizar gangliósidos ou proteínas em suspensões de células de células T CD4 + ou de outras células imunitárias (por exemplo, PMBC, figura 5) a partir de um pequeno número de células. Devido ao tamanho pequeno de células T e as propriedades não-aderentes, a aquisição de imagens microscópicas de fluorescência resulta em informação deficiente ou baixa qualidade, se as células não são correctamente aderida. <p class="jove...

As células T CD4 + orquestrar a resposta imune através das suas funções efectoras após activação por apresentação de antigénio de células 1. O estudo dos mecanismos celulares que são modulados durante a activação permite uma visão sobre um processo básico da função imune. No entanto, o estudo de células T CD4 + naive pode ser complicado porque representam uma população muito pequena de células na periferia sangue 2. Por meio de microscopia de fluorescência vários relatórios estudaram a localização de diferentes moléculas envolvidas na activação de células T CD4 +, principalmente proteínas associadas à membrana plasmática 3. Os gangliósidos são glicosfingolípidos que contém ácido siálico e embora tenham sido extensivamente estudados em células nervosas, onde eles são abundantes, outras células, tais como células do sistema imunológico, também expressam gangliosidos com funções biologicamente relevantes 4,5. Nós relatado anteriormente thaT durante a activação de células T CD4 + naive humanas existe uma regulação positiva do α2,8 sialiltransferase ST8Sia 1 (GD3-sintase) e a sintase GM2 / GD2, que induzem a neoexpression superfície significativa de GD2 e a regulação positiva de gangliósido GD3 6. Um estudo mais aprofundado de GD3, GD2 e outros gangliósidos em células do sistema imunológico é necessária para complementar uma vista parcial à base de proteína de função imunológica. Geralmente, o estudo da expressão de gangliósido é baseado em técnicas tais como cromatografia em camada fina (TLC) 7, mas esta técnica não permite que a localização espacial de gangliósidos na membrana plasmática ou em compartimentos subcelulares, limitando análise biológica. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para a identificação de anticorpos e mediada por localização de GD3 e GD2 gangliósidos em células T CD4 + naive humanas PBMC e depois com anti-CD3 / anti-CD28 de activação. Com este protocolo que ié também possível analisar o gene e a expressão de gangliósidos molecular num baixo número de células em suspensão, com a aquisição de imagens de alta qualidade 6, considerando o tamanho pequeno dos linfócitos (9 jiM).

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

Os métodos aqui descritos para a activação de células T CD4 + naive em suspensão e a sua aderência em lamelas para análise por microscopia confocal de permitir que a localização espacial e a visualização de gangliósidos envolvidos na activação de células T CD4 +, que a expressão do complemento profiling experiências, tais como citometria de fluxo, Western borrar ou PCR em tempo real. A quantificação da expressão gangliósido através de citometria de fluxo e a sua localização celular através de microscopia pode ser obtido através da utilização de anticorpos anti-gangliósidos com elevada afinidade e especificidade. No entanto, um tratamento adequado de células em suspensão envolve o tratamento de placas de cultura para promover a adesão necessária exigida para a fluorescência ou a aquisição de microscopia confocal. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para determinar GD3 e GD2 expressão gangliósido e co-localização com a TCR durante a ativação de células CD4 + T naïve. Além disso, real-time experiências de PCR utilizando &lt;40.000 células são descritos para a determinação da GD3 e genes da sintase de GM2 / GD2, demonstrando que as experiências de análise genética pode ser realizada com um baixo número de células e, sem a necessidade de kits adicionais baixos de ARN de entrada.

O protocolo descrito neste manuscrito torna uma boa qualidade de cultura e de repouso e aderiu células naive humanas activadas T CD4 + (Figura 1). As células T CD4 + activadas mostram o perfil característico proliferativa (Figura 1B), em comparação à condição de repouso (Figura 1A). O marcador de activação CD25 tarde é útil para avaliar a activação eficiente a 72 h observado por microscopia confocal <s...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR &lt;40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.5K visualizações.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR 

Vídeo: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biologia

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Bioquímica

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Neurociência

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

Um ensaio baseado em fluorescência usando linfócitos projetados para triagem de compostos imunomoduladores

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

Preparação de CD4

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo