Gangliosides são expressos em todas as superfícies celulares vertebrados e são especialmente abundantes em células nervosas. Eles regulam a sinalização celular e o reconhecimento celular-celular. Este protocolo introduz o isolamento e análise do ganglioside.
As técnicas foram selecionadas para maximizar os rendimentos do ganglioside em grandes e pequenas escalas, ao mesmo tempo em que simplificam a purificação. Também descrevemos métodos para realizar relativamente rapidamente análises qualitativas e semiquantitativas do lado do gângster. O estudo sobre lipídios, especialmente lipídios polares como gangliosides, requer diferentes ferramentas e técnicas do que trabalhar com proteínas ou ácidos nucleicos.
Este vídeo familiariza você com como trabalhar com essas moléculas. Como solventes como clorofórmio e tetrahidrofurano dissolvem plásticos comuns, usamos garrafas de vidro e frascos com tampas forradas com Teflon, pipetas de vidro, vidro, microsingas de aço inoxidável e homogeneizadores de vidro Teflon durante esses procedimentos. A não orealização resulta em polímeros plásticos nos produtos que podem interferir nas análises.
Para começar, adicione 4,1 mililitros de água por grama de peso molhado de tecido, e homogeneize-o com 10 tacadas. Adicione 13 mililitros de metanol por grama de tecido. Transfira para uma temperatura ambiente de 22 graus Celsius, e misture.
Transfira o tecido para um tubo de parede grossa, vidro, tampa de parafuso com uma tampa de parafuso forrada com PTFE e misture bem. Adicione 6,5 mililitros de clorofórmio por grama de tecido, tampe-o e misture bem. Centrifugar a 450 vezes g por 15 minutos.
Em seguida, transfira o supernatante claro para um tubo fresco e tampado por parafusos e meça o volume como volume de extrato recuperado. Para particionamento, adicione 0,173 vezes o volume de extrato recuperado de água ao supernanato claro. Então cap-lo.
Vórtice vigorosamente. Centrifugar a 450 vezes g por 15 minutos. Transfira a fase superior, que contém os gangliosides, em um tubo de vidro fresco com uma tampa de parafuso forrada com PTFE.
Para realizar a cromatografia do cartucho em fase inversa, use uma seringa de vidro de cinco mililitros para lavar um cartucho de extração em fase sólida tC18 com três mililitros de metanol. Em seguida, adicione três mililitros de clorofórmio-metanol-água a uma proporção de 2 a 43 a 55. Carregue a fase superior da etapa anterior no cartucho tC18 através da mesma seringa de vidro.
Colete o fluxo-through e recarregue-o na coluna para otimizar a adsorção. Lave o cartucho com três mililitros de clorofórmio-metanol-água e, em seguida, com três mililitros de água de metanol. Elute o gangliosides com três mililitros de metanol em um tubo fresco, com tampa de parafuso.
Evaporar até a secura sob um fluxo suave de nitrogênio a uma temperatura inferior ou igual a 45 graus Celsius. Dissolva-se em metanol a um mililitro por grama de peso molhado de tecido original. Coloque 100 gramas de matéria cinzenta cerebral em um liquidificador, e adicione um mililitro por grama de peso úmido cerebral de frio, tampão fosfato de potássio de 10 milimolar de pH 6.8.
Em seguida, homogeneize em baixo por 20 segundos. Adicione oito mililitros de tetrahidrofurano por grama de peso úmido cerebral, e homogeneize em baixo por 10 segundos. Decante em garrafas de centrífugas de vidro, e centrífuga a 5.000 vezes g por 15 minutos.
Colete o supernante, meça seu volume e, em seguida, transfira-o para um funil separador de vidro. Adicione 0,3 mililitros de éter etílico por mililitro do supernatante. Agite vigorosamente.
Em seguida, deixe-o ficar imperturbável por 30 minutos, durante os quais duas fases, uma fase superior do éter e uma fase aquosa inferior, se separam. Colete a fase inferior, que contém os gangliosides, em uma garrafa de vidro com uma tampa alinhada com PTFE. À fase superior do éter restante no funil separador, adicione 0,1 mililitros de água por mililitro de supernanato original da etapa anterior.
Agite vigorosamente. Permitir que as fases se separem. Em seguida, colete a fase aquosa inferior e misture-a com a fase inferior coletada anteriormente.
Evaporar as fases inferiores combinadas para um pó seco, e pesá-lo. Para realizar a cromatografia em fase inversa, pré-lave um cartucho de extração em fase sólida tC18 em larga escala, passando 50 mililitros de solventes através da coluna usando vácuo ou pressão por menos de um minuto por lavagem. Carregue a fase superior da separação da fase pós-saponificação na coluna por vácuo ou pressão.
Em seguida, colete o fluxo-through, recarregue-o e colete o fluxo novamente para análise subsequente. Lave a coluna com 30 mililitros cada um de clorofórmio-metanol-água, seguido de água metanol. Em seguida, elute os gangliosides com 50 mililitros de metanol e, em seguida, novamente com 10 mililitros de metanol.
Colete cada lavagem e eluição separadamente. Use cromatografia de camada fina, ou TLC, para confirmar que os gangliosides estão ausentes do fluxo e lava e eluiram na primeira elução do metanol. Evaporar os gangliosides elucidos para um pó seco, e pesá-los.
Para executar o TLC, despeje solvente em uma câmara TLC de vidro de 10 por 10 centímetros com uma tampa de aço inoxidável para que a profundidade do solvente seja de 0,5 centímetros. Cubra a câmara e deixe-a equilibrar por cerca de 10 minutos. Lave uma seringa Hamilton de 10 microliter com uma agulha chanfrada usando metanol.
Desenhe um microliter de metanol em uma seringa de vidro para encher o volume morto da agulha e, em seguida, um microliter de amostra ou padrão. Localmente a amostra uniformemente nas linhas pré-marcadas de cinco milímetros até que menos de um microliter de solvente de metanol permaneça na seringa. Deixe a placa secar a 22 graus Celsius depois que todas as amostras forem avistadas.
Coloque a placa manchada e seca sobre a câmara TLC pré-equilibrada com a borda inferior imersa no solvente em execução. Deixe que o solvente em execução avance pela placa por ação capilar até que a frente do solvente atinja dentro de um centímetro da parte superior da placa. Retire e marque a frente do solvente na borda da placa com um lápis.
Permita que os solventes evaporem completamente imperturbáveis ou sob fluxo de ar suave. Em um capô de fumaça química, coloque a placa TLC com a extremidade de origem de gangliosides resolvida de cabeça para baixo em uma caixa de papelão cortada para proteger as paredes do capô do spray ácido. Coloque reagente de spray de resorcinol em um pulverizador de TLC de vidro.
Anexe-o a uma fonte de nitrogênio pressurizado e pulverize levemente a placa diagonalmente nas direções vertical e horizontal. Cubra imediatamente a placa com uma placa de cobertura limpa, seca e de vidro das mesmas dimensões e fixe a placa de cobertura no lugar com clipes de aglutinante. Aqueça a placa coberta a 125 graus Celsius por 20 minutos.
Gangliosides aparecerá roxo escuro contra um fundo branco. Para realizar a coloração lipídica, mergulhe a placa TLC com o lado de origem do gangliosides resolvido para baixo em um béquer contendo a mancha de anisaldeído. Submerso na frente por pouco mais de dois segundos.
Em seguida, deixe-o drenar. Aqueça a placa TLC em uma placa quente a uma temperatura baixa para se desenvolver. Este protocolo fornece gangliosides em quantidade e pureza suficientes para determinação qualitativa e quantitativa.
A resolução tlc de um microliter fornece material amplo para detecção de resorcinol e resolve todos os principais gangliosides cerebrais para camundongos selvagens e geneticamente modificados. Embora os gangliosides mistos preparados não estejam livres de outros lipídios importantes, eles são de pureza suficiente para a determinação espectrométrica de massa, seja como gangliosides purificados nativos no modo negativo ou após a pré-metilação no modo positivo. A purificação em larga escala inclui extração, saponificação e resolução hplc para fornecer gangliosides cerebrais cerebrais purificados adequados para experimentos biológicos e para outras modificações químicas e enzimáticas.
Um perfil HPLC exemplar e uma análise TLC subsequente são mostrados. O tratamento alcalino, ou saponificação, é necessário para hidrificar e remover fosfolipídios contaminantes, mas também hidrificar modificações naturais de gangliosides como ácidos sálicos o-acetilados, que podem ser importantes em alguns contextos. As razões precisas de solventes para extração, partição de solventes e resolução TLC são fundamentais para melhorar a recuperação, a pureza e as análises.
Do câncer ao metabolismo à função cerebral, os gangliosides são modificadores fisiológicos e alvos terapêuticos. Isolamento, purificação e análises de ganglioside são pilares para descoberta biomédica e desenvolvimento terapêutico.
