Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Periphere Blut von gesunden männlichen Spendern wurde mit Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung des Ausschusses für Bioethik des Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos erhalten. 1. Isolierung und Aktivierung von humanen naiven CD4 + T - Zellen <ol><li> Sammeln 2 ml peripherem Blut abgeleitet von gesunden menschlichen Spendern durch informierte Zustimmung und verdünnt mit 2 ml sterilem PBS-EDTA (1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Fügen Sie das verdünnte Blut langsam oben auf 3 ml Saccharose - Lösung mit 1,077 Dichte wie zuvor 8 beschrieben. Hinweis: differentielle Migration während der Zentrifugation durch Unterschiede in der Dichte verursacht wird Erythrozyten verursachen vollständig und eine Schicht aus weniger dichten mononukleären Zellen sedimentieren oberhalb bilden. 2 ml von peripherem Blut etwa 0,5 x 10 6 naive CD4 + T - Zellen nach der purificati rendernauf Schritte. </li><li> Zentrifuge 30 min bei 250 × g bei 21 ° C (Verwendung Rotor für Rundbodenröhrchen mit festen Winkel von 30 mm) ohne Unterbrechung des Gradienten von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Nach der Zentrifugation kann die PBMCs eindeutig als weißer Ring beobachtet werden. Sammeln Sie die PBMCs mit einer Pipette und Transfer zum sterilen Röhrchen zum Waschen. </li><li> Nach drei Waschungen mit PBS-EDTA - Lösung bei 250 × g für 10 min ablaufen zur Reinigung von naiven CD4 + T - Zellen. Sortierverfahren oder mehrere Arten von Reinigungs Kits sind für diesen Zweck zur Verfügung. Vorzugsweise verwenden&gt; 1 x 10 7 PBMCs zur Reinigung. <ol><li> Reinige naive CD4 + T - Zellen durch negative Selektion mit magnetischen Kügelchen. Führen negative Selektion mit anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR und CD235a (Glycophorin A) Antikörper. Beurteilen Sie den Prozentsatz der Reinheit durch die Bestimmung CD4 + CD45RA + Zellen durch fLow-Zytometrie. Hinweis: Optional, gehen über Nacht Inkubation von PBMCs bei 37 ° C und 5% CO 2 mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in 10 ml supplementiertem Medium monocyte Adhärenz zu fördern und weiterhin mit naiver CD4 + T - Zell - Reinigung. Die effiziente Gewinnung von naiven CD4 + T - Zellen aus peripherem Blut hängt weitgehend von dem Reinigungssystem. </li></ol></li><li> Vorbereitung 24-well-Zellkulturplatten durch Zugabe von 250 &amp; mgr; l pro Vertiefung von PBS mit 5 &amp; mgr; g / ml anti CD3 monoklonaler Antikörper und Inkubation bei 37 ° C mindestens 2 h für. Hinweis: Platten mit 96 Vertiefungen verwendet werden , wenn eine kleinere Anzahl von naiven CD4 + T - Zellen verwendet werden (zB 2 x10 4 -1 × 10 5). </li><li> Entfernen Sie die anti CD3-Antikörper Verdünnung aus dem 24-Loch-oder 96-Well-Platten und waschen Sie die Platten zweimal mit sterilen 1x PBS. </li><li> Verdünnen der naiven CD4 + T - Zellen mit&gt; 95% Reinheit (CD4 +CD45RA +) auf eine Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in advanced RPMI 1640 - Medium mit 3% fötalem Rinderserum (oder RPMI mit 10% Serum ergänzt), 2 mM Glutamin und Antibiotika (1 U / ml Penicillin, 1 &amp; mgr; g / ml Streptomycin). Hinweis: Wenn Gangliosid Lokalisierung in PBMCs erforderlich ist, folgen dem gleichen Protokoll zur Verdünnung und Stimulation wie unten beschrieben. </li><li> In 500 ul der Zellverdünnung zu anti CD3-beschichteten Vertiefungen und auf nicht-beschichteten Vertiefungen (Kontrollzellen) in der 24-Well-Platte. Alternativ dazu werden 100 ul der Zellverdünnung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Füllen Sie die Stimulationsbedingungen von naiven CD4 + T - Zellen in anti CD3 - beschichteten Vertiefungen durch Zugabe von 1 &amp; mgr; g / ml anti - CD28 - Antikörper. </li><li> Halten die ruhenden CD4 + T - Zellen als Kontrolle in den nicht-beschichteten Vertiefungen ohne Zusatz von anti CD28 Antikörper. Inkubieren Sie die ruhenden und aktivierten CD4 + T - Zellen für 0-72 h unter Standardbedingungen von 37 °C und 5% CO 2. </li><li> Um zu überprüfen , eine ausreichende Aktivierung zu bewerten durch Durchflusszytometrie der Expression des CD69 frühen Aktivierungsmarker (16 Stunden nach der Aktivierung) oder CD25 späten Aktivierungsmarkers (48 Stunden nach der Aktivierung) in ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T bei 37 ° C inkubierten Zellen und 5% CO 2 in Abwesenheit oder Anwesenheit von anti CD3 / CD28 - Antikörper 9,10. </li></ol> 2. Die Einhaltung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen <ol><li> Sterilisieren 12 mm runden Deckgläsern durch Autoklavierung und UV-Lichtexposition für mindestens 15 min. </li><li> Platz Deck in sterile 24-Well-Zellkulturplatten. Hinweis: Bei Kulturen , die mit weniger als 1 x 10 5 Zellen es bevorzugt ist , mit angepaßten kleinen Vertiefungen slide Kammern zu verwenden Dispersion von Zellen in dem Deckglas zu verhindern. </li><li> Coat Deckgläser (oder Gleitkammer) mit 200 &amp; mgr; l Poly-L-Lysin (MG 150-300 KDa) 0,1% (w / v) Lösung und Inkubation für 5 min bei room Temperatur (RT), zu entfernen und trocken für mindestens 1 Stunde bei RT. </li><li> Vorsichtig mischen und sammeln Sie die ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen aus den 24-Well - Platten. Zählen Sie die Zellen und bei Bedarf anpassen mit frischem ergänzten Medium zu übertragen , 1 x 10 5 Zellen auf die Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser. Inkubieren der Zellen für mindestens 6 Stunden bei 37 o C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Sammeln und Fixierung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen <ol><li> Das Medium von kultivierten ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen vorsichtig entfernen. </li><li> In 500 ul RT sterilem PBS langsam. Hinweis: vorsichtige Zugabe und Entnahme von Lösungen aus den Vertiefungen verhindert, dass die Ablösung von Zellen aus dem Deckglas. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie eine weitere 500 ul PBS gründlich Kulturmedien entfernen. </li><li> Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l filtrierte 4% Paraformaldehyd (filtRation entfernt Mikropartikel, die mit Mikroskopie-Analyse) und Inkubation für 30 min bei RT (bevorzugt) oder über Nacht bei 4 ° C stören können. Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige und flüchtige Verbindung. Es ist bekannt, ein menschliches Karzinogen zu sein. Verwenden Sie sorgfältig mit einem geeigneten Sicherheitsprotokoll. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen mindestens zweimal mit PBS bei RT. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder halten die Plattenvertiefungen mit 500 ul PBS bei 4 ° C für mehrere Tage, bis Färbung. Hinweis: Sterility während dieses Prozesses hilft das Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden. </li></ol> 4. Die Färbung, Montage und Visualisierung durch konfokale Mikroskopie <ol><li> Entfernen Sie die PBS aus den Vertiefungen. Hinzufügen 500 ul kaltem Blockierungspuffer (1x PBS, 0,5% Standardqualität Rinderserumalbumin, 1% fötalem Rinderserum, pH 7,4). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis. </li><li> Entfernen Sie den Blockierungspuffer sorgfältig und fügen Sie die primären Antikörper (anti Ganglioside GD3 Klon R24, GD2 Klon 14G2a),PE-konjugiertem anti CD25 und APC-konjugiertem anti-TCR und Isotypen in Blockierungspuffer auf 2,5 &amp; mgr; g / ml verdünnt Kontrollen. </li><li> Inkubiere 2 h auf Eis oder über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Langsam orbitale Bewegung bevorzugt. </li><li> Entfernen Sie den Antikörper vorsichtig und langsam mit 500 ul PBS. Zweimal wiederholen. </li><li> Fügen Sie die sekundären Antikörper (FITC konjugiertem anti IgG3 für R24 ​​anti GD3, Alexa Fluor 488 konjugiert oder Alexa Fluor 647-konjugiertem anti IgG2a für 14G2a anti GD2) verdünnt Puffer auf 0,1 &amp; mgr; g / ml in Blocking. </li><li> Inkubieren für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln ohne Schütteln. </li><li> Waschen dreimal in PBS wie in 4.4) beschrieben. Halten Sie die Vertiefungen mit PBS genug, die Entwässerung von Proben zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen Hoechst 333.258 stain verdünnt in PBS auf 0,1 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Inkubiere 15 min bei RT und zu entfernen. Waschen dreimal in PBS. </li><li> Legen Sie die Folien auf einem Papiertuch und fügen Sie 20 ul Befestigungslösung (50% Glycerin in PBS) oder kommerzielle Montagelösungs zu vermeiden, Fading und Abschrecken von Proben. </li><li> holen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer feinen Pinzette und legen Sie es auf die Montagelösung. Sicherzustellen, dass die Seite der Deck wo Zellen gebunden sind in Kontakt mit der Lösung ist. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack und analysieren Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. </li></ol> 5. Isolierung von RNA <ol><li> Bereiten anti CD3-Antikörper (5 ug / ml) beschichtete 96-Well-Platten. Inkubieren 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen / Vertiefung in 100 ul Kulturmedium , supplementiert mit anti CD28 - Antikörper (1 ug / ml) , um den Stimulus zu vervollständigen. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 0-72 Stunden. </li><li> Nach verschiedenen Post-Aktivierungszeiten setzen die Zellen in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Hinzufügen 500 ul PBS und Zentrifugation bei 250 xg für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 1ml Trizolreagenz. </li><li> Inkubieren für 5 min bei RT und halten Sie die Probe bei -8076; C für mindestens 24 Std. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wenn nötig. Hinweis: Verlassen der Probe bei -80 ° C für mindestens 24 Stunden verbessert RNA-Ausbeute. Verwendung von Handschuhen Auch ist wichtig, RNA-Abbau durch RNasen zu vermeiden. </li><li> Abzutauen die Probe durch Inkubation bei 37 ° C für 2 min in einem Wasserbad. </li><li> In 200 ul Chloroform und kräftig mit der Hand für 30 Sekunden (gegen aggressive Mischung von RNA vermeiden durch Vortexen). Inkubiere 5 min bei RT. </li><li> Zentrifuge 15 min bei 12000 × g bei 4 ° C. </li><li> Wiederherstellen der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 500 ul Isopropanol und wird das Röhrchen dreimal. </li><li> Inkubiere 10 min bei RT und zentrifugieren für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen durch Umdrehen. </li><li> 1 ml eiskaltem 75% Ethanol und Zentrifuge 10 min bei 12000 × g bei 4 ° C. </li><li> Vollständig den Überstand verwerfen und öffnen, indem man den Deckel des Rohres das RNA-Pellet trocknen. Nichte: An diesem Punkt ist das Pellet nicht deutlich sichtbar. Fahre dennoch fort. </li><li> Das Pellet in 20 ul UPW Wasser. Berechnen der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren durch Messen der 260 nm und 280 nm Extinktion unter Verwendung von Nanodrop. </li><li> Gehen Sie sorgfältig, um die Synthese von cDNA mit einer herkömmlichen Reverse-Transkriptase-Kit und nach dem Herstellerprotokoll. Anmerkung: Ungefähr 0,5-2 &amp; mgr; g RNA wird erhalten aus 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen. cDNA kann von 100 ng RNA verwendet, und in Echtzeit-PCR-Reaktionen, ohne die Notwendigkeit für niedrige Eingangs RNA Kits synthetisiert werden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden , Ganglioside oder Proteine in Zellsuspensionen von CD4 + T - Zellen oder andere Immunzellen (zB PMBCs, 5) aus einer kleinen Anzahl von Zellen ausgehend zu lokalisieren. Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen und nicht-haftenden Eigenschaften, den Erwerb von fluoreszenzmikroskopische Bilder führt zu einer schlechten Informationen oder niedriger Qualität, wenn die Zellen nicht richtig eingehalten werden. <p class="jove_content...

Die CD4 + T - Zellen dirigieren , die Immunantwort durch ihre Effektorfunktionen nach Aktivierung durch Antigen - präsentierende Zellen 1. Die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die während der Aktivierung moduliert werden können Einblick in eine grundlegende Prozess der Immunfunktion. Jedoch kann die Studie von naiven CD4 + T - Zellen kompliziert sein , weil sie eine sehr kleine Population von Zellen im Blut Peripherie 2 darstellen. Durch Fluoreszenzmikroskopie Mehrere Berichte haben die Lokalisierung verschiedener Moleküle beteiligt in CD4 + T - Zell - Aktivierung untersucht, vor allem Proteine an die Plasmamembran 3 verbunden. Die Ganglioside sind Sialinsäure Glycosphingolipide und obwohl sie in Nervenzellen intensiv untersucht worden , wo sie reichlich vorhanden, andere Zellen, wie Immunzellen sind auch ausdrücken Ganglioside mit biologisch relevanten Funktionen 4,5. Wir berichteten bereits that während der Aktivierung des menschlichen naiven CD4 + T - Zellen gibt es eine Aufregulation der α2,8 Sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 - Synthase) und die GM2 / GD2 - Synthase, dass die signifikante Oberflächen neoexpression von GD2 induzieren und die Hochregulation von GD3 Gangliosid 6. Weitere Studien von GD3, GD2 und andere Ganglioside in Immunzellen notwendig ist, ein Protein-basierte Teilansicht der Immunfunktion zu ergänzen. Üblicherweise wird die Untersuchung von Gangliosid - Expression auf Techniken wie Dünnschichtchromatographie (TLC) 7 basiert, aber diese Technik die räumliche Lokalisierung von Gangliosiden an der Plasmamembran oder in subzellulären Kompartimenten nicht erlaubt, biologische Analyse begrenzen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Antikörper-vermittelte Identifizierung und Lokalisierung von GD3 und GD2 - Ganglioside in der menschlichen naiven CD4 + T - Zellen und PBMCs nach anti-CD3 / anti-CD28 - Aktivierung. Mit diesem Protokoll es is auch möglich , das Gen und molekularen Expression von Gangliosiden in einer geringen Anzahl von Zellen in Suspension mit dem Erwerb von Bildern hoher Qualität 6, unter Berücksichtigung der geringen Größe von Lymphozyten (9 &amp; mgr; m) zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

Die hierin beschriebenen Verfahren zur Aktivierung von naiven CD4 + T - Zellen in Suspension und deren Einhaltung in Deck für die konfokale Mikroskopie Analyse ermöglichen die räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Gangliosiden in CD4 + T - Zellaktivierung beteiligt, dass Komplement expression profiling Experimente wie Durchflusszytometrie, Western Blotting oder real-time PCR. Die Quantifizierung von Gangliosid Expression durch Durchflusscytometrie und ihre zelluläre Lokalisation durch Mikroskopie kann durch die Verwendung von anti-Gangliosid-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität erhalten werden. Dennoch beinhaltet eine angemessene Handhabung von Zellen in Suspension die Behandlung von Kulturplatten die notwendige Haftung für Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Erwerb erforderlich zu fördern. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung GD3 und GD2 Gangliosidexpression und Kolokalisation mit dem TCR bei naiven CD4 + T - Zell - Aktivierung. Auch Real-time PCR Experimente &lt;40.000 Zellen verwendet werden für die Bestimmung des GD3 und GM2 / GD2-Synthase-Gene beschrieben, kann das Gen-Analyse-Experimente zeigen, mit einer geringen Anzahl von Zellen und ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen niedrigen Eingangs RNA Kits durchgeführt werden.

Das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben macht eine gute Qualität der gezüchteten und eingehalten ruhenden und aktivierten menschlichen naiven CD4 + T - Zellen (Abbildung 1). Die aktivierten CD4 + T - Zellen zeigen die charakteristischen proliferative Profil (1B) im Vergleich zu dem Ruhezustand (1A). Der CD25 späten Aktivierungsmarker ist nützlich , um die effiziente Aktivierung bei 72 h durch konfokale Mi...

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Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T - Zellen zu bestimmen. mit &lt;40.000 Zellen sind auch Echtzeit-PCR-Experimente beschrieben, die keine zusätzlichen Low-Input-RNA-Kits erfordern.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.5K Aufrufe.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T - Zellen zu bestimmen. mit 

Serie: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Forschung

Biologie

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Immunologie und Infektion

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Biochemie

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Neurowissenschaften

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

Eine in vitro Technik zur Unterscheidung von GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen von naiven T-Zellen

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

Herstellung von CD4

Zusammenfassung

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