Sra Alster, o Sr. Honrath e Dr. Jiang são apreciados pela sua excelente assistência técnica. Também é apreciado Dr. Volz e do grupo de pesquisa do Dr. Dandri para fornecer o acesso ao seu dispositivo de PCR digital.

1. Preparação da mistura de cultura contendo ambas as células tumorais e células não tumorais <ol><li> Use de células tumorais a partir de uma linha celular estabelecida MPNST S462 5. Use fibroblastos como as células não tumorais 6,7 </li><li> Culturas tanto tumorais células e fibroblastos em meio DMEM padrão com 10% de soro fetal de bovino (BSA), glutamina 3 mM, 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina 0,1, 500 g / ml de estreptomicina e piruvato de sódio 1 mM a 37 ° C e 5% de CO 2 5-7. Na sub-confluência, a colheita das células com 0,05% de tripsina e contá-los usando um hemocitômetro. </li><li> Misturar 400 células tumorais e 1.600 células não tumorais em conjunto em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços em 0,2 ml de meio. Considerando-se um crescimento mais rápido das células de tumor ao longo do período de tratamento de 5 dias, a proporção inicial de células de tumor foi fixada em 25%. Configurar 4 repetições para cada concentração da droga. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tratamento <ol><li> Use nilotinib como o fármaco de teste. Preparar soluções estoque de nilotinib 0, 2, 4 e 20 mM em DMSO. Dilui-se cada uma delas por 200 vezes em 5 ml de meio DMEM, dando 2-fold-droga soluções concentradas de 0, 10, 20 e 100 uM 6,7. </li><li> Retirar 0,1 mL de meio de cada poço e adiciona-se 0,1 ml de meio contendo droga. As concentrações finais são 0, 5, 10 e 50 uM. Continuar a incubação das células em meio contendo droga durante 5 dias. </li><li> No final do tratamento, inspeccionar as células ligadas utilizando um microscópio de contraste de fase e tirar fotografias. Aspirar o meio de distância, lavar as células sobreviveram adesivas uma vez com 0,2 ml de PBS. </li></ol> 3. Preparação de DNA para PCR Digital <ol><li> Células Lyse usando HotShot 8. <ol><li> Adicionar 50 ul de solução de lise alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada poço. Selar os poços com papel alumínio. Incubar a placa a 95 ° C num forno ou sobre uma placa de aquecimento durante 30 min. Verifique sob um microscope para certificar-se que não há mais células intactas permaneceu na superfície dos poços. No caso de as células não lisar completamente, aumentar o tempo de aquecimento ou adicionar detergente. Congelá-los uma vez a -20 ° C, também aumenta as células quebrar. </li><li> Adicionar 50 ul de solução (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada poço neutralizantes. Transferir todos os lisados ​​em formato U poços de uma placa de PCR e seco em um aparelho de ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir o lisados ​​com 20 l de água destilada. </li></ol></li><li> Desalt usando Drop-diálise 9 <ol><li> utilizar os filtros de membrana com tamanho de poro médio de 0,025 | im. </li><li> Flutuador do filtro em água destilada com brilhante para cima lado em poços de uma placa de 12 poços. Molhar o filtro durante 5 min. Prestar atenção para evitar bolhas de ar entre o filtro e água. </li><li> Pipetar os lisados ​​reconstituídas de cada amostra a partir do passo 3.1.4 em cuidadosamente em cada um dos 4 áreas do filtro. Cobrir a placa e dializar durante 30 a 60 min. </li><li> Sugar a água sob o filtro sem capotar o filtro nem perturbar as gotas. </li><li> Transferir o lisado-gotas em poços de uma nova placa de PCR-. Secam-se as ADN-gotas por aquecimento a 95 ° C durante 10 a 30 minutos num termociclador de PCR. Reconstituir o lisados ​​em 10 ul de água. </li></ol></li></ol> 4. PCR Digital <ol><li> componentes congelados descongelamento, tais como DNA, buffer ea mistura de ensaio à temperatura ambiente, spin para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e, em seguida, mantê-los no gelo. </li><li> Prepare a mistura mestre contendo todos os componentes, excepto o DNA (Tabela 1). Considere o volume morto e calcular mistura mestre cerca de 10% mais do que a quantidade necessária. Nota: Use os iniciadores e sondas utilizadas no kit comercial. </li><li> Vortex da mistura mestre, girar para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e dispensar 15 ul a cadapoço de uma placa de 96-PCR. Adicionar todos lisado (que contém ADN) de cada amostra para os poços que contêm a mistura mestre. Transferir 20 uL de cada mistura reaccional para dentro de um poço no lado da amostra de um cartucho à TA. </li><li> Pipetar 70 ul de óleo gerador de gotícula em cada cavidade no lado do óleo de um cartucho. Fechar o cartucho com a junta de vedação e colocar a configuração em todo um gerador de gotícula. Iniciar a geração de gotículas. </li><li> Transferência gota-solução de 40 ul nos poços de uma placa de PCR de 96 poços. Selar a placa com uma folha e colocar a placa num aparelho de ciclos de PCR. Definir a tampa temperatura a 105 ° C e de rampa taxa de 2 ° C / seg. Levar a cabo PCR usando as definições na Tabela 2. Após o PCR, transferir a placa para um leitor de gotícula e começar a ler. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 24 h. </li></ol> 5. Cálculo Proporção de Células Tumorais <ol><li> Carregar os dados PCR digital e executar analys automáticasé. </li><li> Controlar os resultados de cada ensaio manualmente através do controlo da distribuição de uma dimensão e de 2-dimensional das gotículas positivos e negativos, e a certeza de que eles são bem separados e as linhas de limiar foram nas posições certas. Excluem os resultados não satisfaz os critérios, por exemplo, há uma clara separação de gotículas positivos e negativos, a partir de uma análise mais aprofundada. Copie o maior rácio de NF1 / RPP30 em uma folha de excel. </li><li> Calcular a proporção de células tumorais como: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> Mudança 6. Dose-dependente da proporção de células tumorais <ol><li> Para cada fármaco-concentração, calcule a média eo desvio padrão das 4 repetições. Traçar os meios e os desvios-padrão contra o consumo de droga concentrações. </li></ol>

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	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

O passo chave nesta ferramenta genético-e à base de células para avaliar a especificidade de drogas in vitro é a determinação da proporção de células de tumor, utilizando um ou mais recursos genéticos específicos do tumor. Em contraste com características fenotípicas convencionais 7, características genéticas são específicos, estável e fácil de quantificar. Por exemplo, uma mutação ou variação do número de cópias específico do tumor está presente exclusivamente em células tumorais, mas não em células não tumorais. Tal estigma genética pode ser fiável e quantificado precisamente, por exemplo, utilizando PCR digital como demonstrado no presente estudo. Para a PCR digitais, de alta pureza de ADN não é essencial. No entanto, dessalinização e remoção das moléculas inibidoras são necessários o que pode ser conseguido por uma gota-a diálise utilizando um filtro adequado. A lise e gota-a diálise combinada é simples e rápido, não requer instrumentos especiais e, por conseguinte, pode ser realizado em qualquer laboratório padrão. Se as células não Break bem, tratamento adicional pode ser considerado tal como a congelação das células a -20 ° C, adicionando detergentes e / ou utilizando protease. No presente estudo, a supressão heterozigoto do gene NF1 foi usado como o recurso específico de tumor para a quantificação. Da mesma forma, também pode ser utilizado deleções de outros genes ou loci. Além disso, as mutações também podem ser utilizadas para quantificar as células tumorais. Em tal caso, os ensaios de PCR para o mutante digitais e os alelos normais têm de ser extensivamente validado para garantir a sua especificidade para cada um deles. proporção dependente da dose de células de tumor fornece uma indicação para o fármaco-especificidade ou selectividade. Além disso, ela também permite extrair a resposta das células tumorais a partir da resposta do número total de células de uma cultura mista de uma droga (Figura 4). Esta estratégia de extracção fornece uma solução para o problema técnico em utilizar culturas primárias (que contém tanto do tumor e nãocélulas de n-tumor) por drogas-teste. A genético-celular e baseada na ferramenta vitro demonstrado no presente estudo pode, portanto, tem potencial de aplicação (1) em droga-descoberta, onde ele fornece uma plataforma para avaliar a especificidade de drogas ou a selectividade in vitro e (2) no tratamento personalizado do câncer onde ele permite drogas de teste em culturas primárias e, consequentemente, pode contribuir para a droga-seleção na quimioterapia adjuvante 4. Além disso, o mecanismo farmacológico de uma droga pode ser estudada usando esta ferramenta, uma vez que certa alteração genética ou alterações genéticas múltiplas podem ser seguidas durante a droga do tratamento. Uma dificuldade na utilização de culturas primárias individualizadas é a falta de uma característica genética universal para a quantificação das células tumorais. No entanto, com o avanço de hoje na sequenciação de todo o genoma, os genes e regiões mais frequentemente alteradas são conhecidos por tumores comuns. Por exemplo, entre cabeça e pescoçotumores, 71%, 23% e 22% têm mutações em TP53, FAT1 e genes CDKN2A, e 60%, 34% e 26% têm deleções nas regiões do gene de CDKN2A, STK11 e PTEN, respectivamente 10. Rastreio de 5 a 10 tais genes e / ou as regiões através de sequenciação-alvo e / ou de PCR digital irá, portanto, provável identificar uma ou mais alterações genéticas que podem ser utilizadas para a quantificação das células tumorais na cultura primária derivada. Outra limitação é a quantidade muitas vezes insuficiente de tumores ressecados para a criação de culturas primárias. Apesar das características vantajosas ea aplicação potencial promissor da genético-e na ferramenta vitro baseado em células, as suas limitações devem ser mantidos em mente e sua natureza in vitro devem ser enfatizados. Por exemplo, os efeitos diferenciais ou citotoxicidade de um fármaco em células tumorais podem, em vez devido à diferença de tipos de células (células de Schwann contra fibroblastos) ou os seusdiferentes origens (de diferentes indivíduos). O efeito mais forte de um fármaco em células tumorais do que em células não tumorais também pode ser explicada pelo facto de que o primeiro crescer mais rapidamente do que o último. Mais importante, as células no comportamento vitro difere do que as células no corpo humano e, consequentemente, os resultados da avaliação in vitro muitas vezes não ou apenas parcialmente reflectir a situação clínica real. Portanto, a eficácia, a citotoxicidade e a especificidade das drogas obtidos para células cultivadas são em vez de biomarcador natureza, mas não têm a fiabilidade da eficácia pré-clinicamente medido de antibióticos. No entanto, movendo-se de linhas celulares para culturas mistas e / ou culturas primárias é um passo em frente na avaliação fármaco-efeito e especificidade / seletividade in vitro. Com grandes esforços, em condições in vitro, pode ser encontrado o que permite uma correlação razoável de dados in vitro com respostas reais dos pacientes, pelo menos para algumas drogas.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table><tbody><tr><td>Membrane filter of 25 mm diameter</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>For drop-dialysis</td></tr><tr><td>ddPCR assay for NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM-labelled</td></tr><tr><td>ddPCR assay for RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX-labelled</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td></tr><tr><td>Droplet oil</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Gaskets</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Cartrige holder</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Pierceble foil</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Um procedimento para avaliar a especificidade de drogas anticancro in vitro utilizando culturas de células que contêm ambos tumorais e não tumorais é demonstrada. O elemento chave é a determinação quantitativa de uma alteração genética específica do tumor em relação a uma sequência universal usando um ensaio de PCR digital duplo-sonda e o cálculo subsequente da proporção de células de tumor. O ensaio é realizado em uma cultura contendo células de tumor de uma linha estabelecida e cravado-em células não tumorais. A cultura mista é tratado com um fármaco de teste a várias concentrações. Após o tratamento, o DNA é preparado directamente a partir das células adesivas sobreviveram em poços de placas de 96 poços utilizando um método simples e barato, e submetido a um ensaio de PCR digital duplo-sonda para a medição de uma alteração genética específica de tumores e uma sequência universal de referência . Na presente demonstração, uma deleção heterozigoto do gene NF1 é usado como a alteração genética específica de tumores eum gene RPP30 como gene de referência. Usando a relação NF1 / RPP30, calculou-se a proporção de células tumorais. Uma vez que a alteração dependente da dose da percentagem de células de tumor fornece uma indicação in vitro para a especificidade da droga, e este ensaio genético à base de células in vitro provavelmente terão potencial aplicação na descoberta de medicamentos. Além disso, para o cancro de cuidados personalizado, esta ferramenta genético-e à base de células pode contribuir para a optimização de quimioterapia adjuvante, por meio de testes de eficácia e especificidade de fármacos candidatos utilizando culturas primárias de tumores individuais.

Qualidade de ADN preparado utilizando o HotShot combinado / Drop-diálise é suficiente para PCR digitais satisfatória (Figura 1B). Por 2.000 fibroblastos, aproximadamente, foram obtidas 3.000 ± 500 gotas positivos, correspondendo a 75% dos esperados 4.000 cópias (duas cópias em uma célula). Neste estudo, as células tumorais foram estabelecidos a partir de uma linha MPNST S462 que são conhecidos por ter uma delecção heterozigoto do gene NF1 5. Esta redução da dosagem do gene 50% foi claramente detectado pelo ensaio de PCR digital duplo (Figura 1B). Em contraste, duas cópias deste gene foram medidos nos fibroblastos. Esta diferença genética entre células tumorais e não tumorais permite o cálculo da proporção de células de tumor em culturas mistas (Figura 2). Ao medir a dosagem do gene NF1 a relação de RPP30, proporção de células de tumor numa cultura mista pode ser determinadaem cada uma das drogas da concentração (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figura 1. Digital PCR. (A) ilustração do princípio. (B) um ensaio de dual-sonda revela quantidade reduzida de um gene alvo (NF1) nas células tumorais MPNST S462 em relação a um gene de referência (RPP30). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figura 2. proporção calculada de células tumorais. As células tumorais e não tumorais células foram misturadas em várias proporções e semeadas em cada poço de uma placa de 96. Após a fixação, O / N wit, as células foram lisadash HotShot / Drop-diálise e os lisados ​​foram dessalinizadas sujeito a PCR digital, que deu o rácio de NF1 / RPP30. Com base neste rácio, foi calculada a percentagem de células de tumor em cada poço. Média e desvio padrão da proporção de células tumorais foram calculados a partir de 4 repetições em cada proporção set-up. As proporções calculadas de células tumorais (eixo Y) foram plotados contra as proporções set-up (eixo X). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figura 3. dependente da dose Mudança da proporção de células de tumor. (A) a redução dependente da dose de células vitais visíveis. (B) a proporção de células de tumor (média e desvio padrão de 4 réplicas) calculada a partir da<html> proporção de NF1: RPP30, diminuição na gama de 0-10? M. Na maior dose de 50? M, poucas células vitais foram deixados, provavelmente devido ao efeito tóxico para todas as células. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figura 4. Resposta de separação de células tumorais a partir das células não tumorais (A) a viabilidade e / ou proliferação de células totais pode ser medida utilizando ensaios convencionais; Proporção de células de tumor pode ser determinada utilizando o procedimento demonstrado no presente estudo. (B) usando os dois parâmetros, a resposta de células totais numa cultura mista para um fármaco pode ser dividido em resposta das células tumorais e a resposta das células não tumorais..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reaction </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mistura de ensaio para NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mistura de ensaio para RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Subtotal </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> mistura mestre </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Mistura de PCR finais </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Configuração dupla ddPCR Reaction <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Açao </td><td> Temperatura </td><td> Tempo </td><td> Cycles </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymapagar activação </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> desnaturação do DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 seg </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Annealing / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> 4 </td><td> desactivação da polimerase </td><td> 98 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Espera (opcional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> A Tabela 2 Configurações Cycler PCR

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K visualizações.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais. 

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Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Química

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines respond to therapeutic compounds in 2D (dimensional) monolayer cell cultures, 3D culture systems were developed to understand the efficacy of drugs in more physiologically relevant models. In recent years, a paradigm shift was observed in pre-clinical research to validate the potency of new molecules in 3D culture systems, more precisely mimicking the tumor microenvironment. These systems characterize the disease state in a more physiologically relevant manner and help to gain better mechanistic insight and understanding of the pharmacological potency of a given molecule. Moreover, with the current trend in improving in vivo cancer models, zebrafish has emerged as an important vertebrate model to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents. Here, we investigated the therapeutic efficacy of hydroxycoumarin OT48 alone or in combination with BH3 mimetics in lung cancer cell line A549 by using three different 3D culture systems including colony formation assays (CFA), spheroid formation assay (SFA) and in vivo zebrafish xenografts.

Here, we present the preclinical screening of anticancer coumarins using 3D culture and zebrafish.

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Pesquisa do câncer

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioengenharia

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Medicina

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs

Resumo

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