Este protocolo é significativo porque trabalhar com sucesso com organoides está nos detalhes, e o campo está faltando protocolos claros e detalhados para outros construirem. A maior vantagem dessa técnica é a escala de tempo, os baixos requisitos de biomassa e a escalabilidade de baixo custo. Embora muito mais trabalho seja necessário, essa técnica poderia ajudar a melhorar o tratamento do câncer de pulmão, permitindo o teste de terapias individuais ou combinadas mais precisas que poderiam ser traduzidas clinicamente.
O maior desafio é lidar com o BME2, amplamente conhecido como Matrigel. Recomendo fortemente praticar a pipetação e manuseio líquido BME2 antes de introduzir seus preciosos organoides. Comece dissociando a cultura organoide BME2 submersa, aspirando cuidadosamente a mídia das placas culturais evitando tocar a cultura.
Trypsinize a cultura organoide BME2 submersa com uma enzima recombinante adequada adicionando dois mililitros de enzima recombinante por poço em uma placa de seis poços. Quebrar mecanicamente o BME2, escaneando repetidamente para cima e para baixo e incubar placas a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por cinco minutos. No final da incubação, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 600 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente.
Aspire a enzima recombinante supernace cuidadosamente sem tocar a pelota organoide e resuspende a pelota organoide em meio de crescimento. Depois de adicionar DNase 1, incubar a suspensão por cinco minutos em temperatura ambiente e centrífuga a 600 vezes G por três minutos em temperatura ambiente. Descarte a mídia cuidadosamente sem tocar na pelota organoide e resuspenque a pelota em um novo meio de crescimento.
Pré-aqueça uma nova placa de fundo claro preto 96 bem a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por 10 minutos, em seguida, prepare uma suspensão celular em PBS para contar as células usando um analisador de células. Após calcular o volume de suspensão celular necessário para o experimento, aliquot as células de suspensão unicelular e pelota para baixo por centrifugação como demonstrado anteriormente. Uma vez que a mídia é descartada, mantenha as células no gelo por aproximadamente um minuto antes de reutilizar no BME2.
Incline a placa de fundo claro preto pré-aquecida 96 em direção ao corpo e semeee cinco microliters de suspensão celular por poço, seguido pela semeadura das cúpulas celulares na posição das seis horas do poço. Encha os poços externos na borda da placa 96 com PBS e semee as cúpulas celulares nos poços internos restantes. Incubar cúpulas celulares recém-semeadas na capa de fluxo laminar da cultura celular por cinco minutos sem mover a placa, em seguida, transferir a placa para a incubadora de cultura celular para incubação a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Adicione cuidadosamente 100 microlitros de meio de crescimento por poço a todos os poços que contêm organoides e 100 microlitros de PBS aos poços externos na borda da placa. Cultura os organoides a 37 graus Celsius durante sete dias, mudando a mídia de acordo com as instruções mencionadas no manuscrito do texto, inspecionando o crescimento de organoides sob o microscópio leve regularmente. Prepare uma diluição de drogas em série em mídia de fator de baixo crescimento para osimertinibe para tratar organoides mutantes mutantes mutantes não-células organoides.
Inclua um controle negativo adicionando mídia de fator de baixo crescimento e DMSO de 0,1%. Gire a placa organoide no sentido horário em 180 graus de tal forma que os organoides agora estejam na posição das 12 horas e aspiram cuidadosamente a mídia de crescimento usando um aparelho multicanal de preferência. Adicione 100 microliters de controle ou solução de drogas por poço.
Incubar organoides tratados novamente a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por cinco dias. Comece a realizar o ensaio de sobrevivência descongelando o reagente durante a noite a quatro graus Celsius. Equilibre o reagente em um banho de água à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso e misture invertendo.
Adicione 100 microliters do reagente a cada poço e misture bem por pipetar para cima e para baixo com a ponta de pipeta colocada na posição da cúpula organoide. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro. Usando uma pipeta multicanal, transfira aproximadamente 150 microliters do lysate para uma nova placa de fundo opaca 96 e, em seguida, incubar a placa por mais 25 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Regissão de gravação usando um leitor de placas ELISA. Salve os dados em um formato de tabela de dados apropriado contendo todas as leituras e gravações brutas do layout da placa e das drogas utilizadas. Os organoides th107 positivos EGFR-mutantes mostraram sensibilidade ao tratamento osimertinibe com uma concentração inibitória meia maximal de 56 nanomolar, enquanto os organoides TH116 positivos EGFR-mutantes eram resistentes ao tratamento de osimertinibe com uma concentração inibitória meio máxima de maior que um micromolar.
A sensibilidade das células cancerígenas de pulmão th107 não-totalmente células-positivas foi acompanhada por alterações transcricionais significativas, incluindo uma redução na expressão de assinaturas genéticas associadas ao ciclo celular e um aumento na expressão da assinatura genética associada à apoptose. A resposta do sensível EGFR-mutante TH330 aos inibidores direcionados é significativamente impactada na mídia de crescimento versus mídia de fator de baixo crescimento. Tratamentos combinatórios em EGFR-mutante positivo TH330 resultaram em aumento da resposta ao tratamento.
Essa abordagem melhora estratégias personalizadas para terapia molecular ou regimes de tratamento combinatório. Este último ajuda a direcionar os mecanismos de tolerância e resistência medicamentosos precocemente para aprofundar a resposta clínica e melhorar os resultados dos pacientes.
