Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH-13-01-0243) e os Institutos Nacionais de Saúde (R37 AG008796). Agradecemos Alan Baker em oficina mecânica da Universidade Northwestern para a construção do aparelho de cilindro fixo-cabeça. Agradecemos ao Dr. Shoai Hattori por sua orientação em MATLAB e Solidworks. Agradecemos ao Dr. John Power para o software LabView que controlava o experimento.

Todos os procedimentos envolvendo ratos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional da Universidade Northwestern e do Comitê Use com base nas diretrizes emitidas pelo Instituto Nacional de Saúde. 1. O cilindro (Figura 2A) <ol><li> Construir o cilindro, como descrito por Chettih et ai. E Heiney et al., A partir de um cilindro de espuma de longa 14-15. Cortar um comprimento de 10 cm de cilindro e perfurar um furo através do centro para encaixar o eixo, um metal haste de 12,7 mm (0,5 pol.) De diâmetro. Montar o cilindro com o seu eixo para uma placa de ensaio óptico de metal tal como descrito por Heiney et al., Ou outro suporte (por exemplo, Plexiglas) 15. </li><li> Erigir duas hastes metálicas verticais de 12,7 mm de diâmetro em cada lado do cilindro. </li><li> Anexar duas montagens de ângulo à direita para as hastes de metal. </li><li> Garantir mais duas hastes (5 cm de comprimento, 12,7 mm de diâmetro) através dos suportes em ângulo reto. Bevel the extremidades destas hastes e nivelar as suas extremidades acima do centro do cilindro (Figura 2G). </li><li> Perfurar e bater um buraco através das extremidades niveladas das hastes para caber dois 4-40 parafusos de máquina que irá realizar as asas do conector no lugar (Figura 2G). </li></ol> 2. Montagem do sistema de estimulação Bigode (Figura 2B) <ol><li> Cortar um segmento de 10 dente de pente de uma pente de cabelo normal. </li><li> Cortar uma fenda de cerca de 2-3 mm de largura e cerca de 5 mm de profundidade na parte superior do pente para aceitar um actuador 2-camada flexão rectangular. </li><li> Soldar um fio de cada uma das superfícies do actuador de flexão. Utilize a solda e fluxo fornecidos pelo fabricante. Cubra o atuador e solda com fita isolante para proteger o mouse eo usuário da corrente elétrica. </li><li> Deslizamento da tira de actuador na fenda cortada no pente de modo que a tira de actuador de flexão fica perpendicular ao plano do pente. Ângulo o pente para que ele está inclinado a 45 ° e mais naturalmente segue a curva do rosto do mouse. </li><li> Prender a extremidade da tira de actuador ao topo do pente com epoxi de secagem rápida. Nota: Os fios soldados à tira de dobra actuador deve ser ligada a um reóstato que liberta 40 volts para o actuador. As experiências anteriores demonstraram que a 40 volts é eficaz para o condicionamento mas não evoca qualquer resposta de sobressalto. </li><li> Coloque o actuador de flexão e o pente em uma montagem móvel. Um suporte de pipeta ligado a uma base magnética, como normalmente utilizado in vitro para electrofisiologia plataformas funciona bem. </li></ol> 3. Montagem do conector que monta para Rods acima do cilindro (Figura 2C, 2E) Nota: O conector é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de nylon 221 séries Amphenol utilizado para a corda por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17. <ol><li> Toque no primeiro buraco na faixa para um 0-80 x-1&quot;Parafuso de máquina. Isto servirá como um parafuso de fixação para fixar a peça de cabeça para o conector. Juntar uma porca 0-80 para a cabeça do parafuso de fixação com cola cianoacrílico com o fim de facilitar a rodar o parafuso à mão. </li><li> Deixar um buraco vazio após o furo roscado (para permitir espaço para a porca 0-80 máquina) e empurre cinco bases relia-tac banhados a ouro através dos restantes cinco buracos. </li><li> Tira o revestimento fora cinco fios longos (fios obtidos a partir de um cabo Ethernet) e solda para as extremidades dos soquetes. Nota: Os dois primeiros fios irá ser utilizado para gravar os sinais de eletromiográficas (EMG) que irá detectar uma resposta eyeblink seguinte filtragem do sinal e amplificação a partir de um amplificador. O segundo dois vai entregar o sinal de choque de um isolador de estímulo. O último fio servirá como uma ligação à terra. Estes fios serão conectados aos sistemas utilizados para a entrega cronometrado CS-US. </li><li> Garantir a conectividade elétrica entre os fios e os sockets com um multiMeter. Coloque o multímetro na configuração da continuidade e segure uma das sondas para o pino e a outra sonda para as extremidades descarnadas do fio. Os pinos e os fios estão ligados electricamente quando a resistência é baixa e o multímetro emite um tom. <ol><li> Alternativamente, se o multímetro não tem uma configuração de continuidade, medir a resistência entre os pinos e os fios. Não há continuidade eléctrica se há muito pouca resistência medida. </li></ol></li><li> Prepare as asas do conector de dois para-220 transistores de estilo. Cortar os fios emissor, base e coletor do transistor e nivelar a superfície para que ele possa ser aposta no conector. </li><li> Cortar a borda da guia de montagem para violar o buraco para que o guia pode deslizar por baixo da cabeça do parafuso. </li><li> Epoxy os transistores ao conector. O furo na guia de montagem vai ser utilizado para fixar o conector para as hastes de cima do cilindro. </li><li> Aplicar epoxi à base de fios protruding a partir das tomadas e permitir que a epoxi seque. O epoxi vai isolar e proteger as ligações. </li></ol> 4. Preparar o capacete (Figura 2D, 2E) Nota: A tira capacete é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de séries de nylon Amphenol 221 usado para o capacete por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.. Esta parte não é mais fabricado comercialmente. O arquivo de impressora pode ser baixado do website do jornal. <ol><li> Toque no primeiro buraco na faixa para um parafuso de máquina 0-80 x 1 &quot;e deixar um buraco vazio após o primeiro buraco. </li><li> Empurrar cinco pinos banhados a ouro através da parte inferior dos restantes cinco furos (através das extremidades mais estreitas). Use um torno para facilitar empurrar os pinos para a faixa uniformemente. </li><li> Usando uma stripper térmica, remover cerca de 0,5 cm de poliimida revestimento fora da extremidade de um fio de aço inoxidável (0,005 pol. De diâmetro), soldar a extremidade descarnada do Wira para a abertura de um dos pinos e de cortar o fio para 0,6-0,7 cm. </li><li> Tira cerca de 0,2 cm a partir da extremidade do fio para permitir que a corrente passe para o animal. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,4 para os restantes três fios. Nota: Os dois primeiros fios irá gravar as respostas EMG, enquanto os outros dois servirão para entregar um choque para o animal. </li><li> Como o último (quinto) do fio vai servir como um fio de terra, cortar cerca de 5 cm de arame de aço inoxidável não revestido (0,005 pol. De diâmetro), e solda para o pino restante. </li><li> Assegurar a continuidade entre os fios e os pinos com um multímetro. (No caso do fio de terra, que é não revestido, a sonda multímetro pode ser colocado em qualquer lugar ao longo do fio). </li></ol> 5. Preparação cirúrgica (Figura 2F) <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo o capacete. Esteriliza-se o capacete por imersão em álcool e, em seguida, a lavagem com solução salina estéril. </li><li> Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com 3-4% vaporized isoflurano misturado com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto. </li><li> Verificar que o animal é completamente anestesiado com uma pitada do dedo do pé. O mouse é totalmente anestesiado quando ele não responder reflexivamente a pitada dedo do pé. </li><li> Uma vez que o animal tenha sido completamente anestesiado, injectar uma dose de cloridrato de buprenorfina como um analgésico (0,05-2 mg / kg, sc), raspar o topo da cabeça do animal, colocar sobre uma almofada de aquecimento coberto na base da armação estereotáxica , verificar que o animal está completamente anestesiado, e proteger a cabeça para o quadro. Manter o fluxo de isoflurano vaporizado ao animal, alternando a 2% com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica para as córneas. </li><li> Desinfectar o couro cabeludo com povidona-iodo e álcool três vezes cada, alternando entre os dois. </li><li> Com uma lâmina de número 10 ou 15 bisturi, fazer uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio a partir da parte dianteira do tele os olhos para além do osso do interparietal (~ 1,5-2 cm). </li><li> Segurar as abas de pele com micro clips. Coloque um grampo acima do olho, um ao longo do meio do eixo rostral-caudal, e um na parte posterior do crânio bilateralmente (isto é, seis usar grampos em tudo). A fim de evitar headpiece avulsão, expor tanto do crânio quanto possível, incluindo os lados e para trás. Isto irá aumentar a área de superfície para a aplicação da película de cimentação adesiva. </li><li> Usando o bisturi, raspagem ao longo da parte superior do crânio para remover o periósteo e assegurar uma superfície de trabalho limpo e seco. Limpar o topo do crânio com 3% de peróxido de hidrogénio três vezes. </li><li> Faça dois furos no crânio com um tamanho 34 burr cone invertido ou 1,6 milímetros fresa de gravar broca para aceitar 00-90 parafusos (0,0625 in. De comprimento). Os parafusos irá fornecer a ligação à terra. Coloque um orifício na frente de bregma, e o outro em frente da Lambda, à esquerda da linha média, quando o condicionamento do Right olho. Coloque um parafuso em cada buraco. Abaixe o parafuso de 0,28 mm no crânio para cada volta completa; duas voltas completas é suficiente. </li><li> Criar vários pequenos torrões de aproximadamente 0,75 mm de diâmetro sobre o crânio, a fim de aumentar a área da superfície e da força de preensão para o cimento. </li><li> Tome o capacete concluído e enrolar o fio terra em uma configuração em forma de oito em torno dos dois parafusos. Permitir alguma folga (~ 1,5 cm entre o capacete eo parafuso) no fio terra assim que o capacete pode ser posicionado corretamente mais tarde. Nota: O número oito geralmente garante uma boa conexão elétrica entre o fio e os parafusos de terra. O fio pode também ser soldado ao parafuso para garantir uma ligação eléctrica. </li><li> Aplicar o cimento cimentação adesiva. Siga as instruções do fabricante para a mistura do cimentação cimento cola ou misture 4 colheres de mix L-Pó, 8 gotas de base, e 2 gotas de catalisador em um prato de mistura de cerâmica fria (garantir a faixa de temperatura on o prato de mistura é completamente preto.) A temperatura fria estende o tempo de trabalho do cimento. <ol><li> Brasão do crânio e os parafusos liberalmente com o cimento resinoso e permitir que o cimento secar. Isto deve levar apenas alguns minutos. </li></ol></li><li> Depois que o cimento secar, coloque o capacete na vertical, com os pinos de pé, acima do crânio. Segurar o capacete no lugar com um suporte semelhante ao conector Nota: Consulte &quot;3. Montagem do conector&quot; O titular só precisa de ser uma faixa de cinco buraco com soquetes banhados a ouro, a fim de receber os pinos do capacete. O titular é anexado a um braço sobre o quadro estereotáxico. O uso do suporte e o braço facilita o posicionamento da peça de cabeça e os fios. </li><li> Após o capacete foi posicionado, descascar a pele ao redor da área periorbital e posicionar os dois fios de choque para permitir que os 0,2 cm extremidade descarnada para descansar debaixo da pele e cerca de 2-4 mm diretamente caudal ao eye. Não permita que as extremidades dos dois fios se toquem. Posicione os dois fios da EMG na muscularis orbicular dos olhos acima da órbita do olho. <ol><li> Se necessário, cortar as pontas dos fios se eles são demasiado longos e parece que eles podem arranhar diretamente a órbita e resultar em infecção. Se cortar as pontas do fio, certifique-se de que não é o suficiente fio desencapado exposto. Em alternativa, se os fios parecem muito tempo, dobrar o fio de volta para a base, onde elas se estendem para fora da peça de cabeça. </li><li> Cimento a base dos fios (ou seja, a extremidade mais próxima da peça de cabeça) no lugar sobre o crânio com um pequeno propagação do cimento cimentação adesiva e deixar secar (utilização metade da porção descrito anteriormente). </li></ol></li><li> Retire as micro grampos e gentilmente dobre as abas de pele para trás sobre o cimento. Permitir que a pele para resolver naturalmente para evitar a tensão em qualquer parte da pele, a fim de evitar distorções da pálpebra, a prevenção da resposta eyeblink,e sofrimento para o animal. </li><li> Selar a área exposta com cimento dental, abrangendo desde a incisão da pele para a borda de topo da peça de cabeça com cimento. Tome cuidado extra para evitar gotejamento de cimento sobre os olhos ou os pinos do capacete. Parcialmente cimento curado podem ser suavizadas e manipulados com um pedaço de algodão umedecido com solvente de cimento dental. Permitir que o cimento secar completamente antes de remover o suporte do capacete. </li><li> Permitir ao animal recuperar da anestesia em uma superfície aquecida antes de substituir o animal de volta em sua gaiola. Administrar Metacam (1 mg / kg, SQ) e, em seguida, colocar o animal de volta em sua gaiola. </li><li> Permitir que o animal 5-7 dias de recuperação antes do teste ou treinamento. Manter cuidados pós-operatórios padrão para o animal de acordo com as diretrizes da sua instituição. O animal deve ser verificado pelo menos uma vez por dia depois de ter recuperado de uma cirurgia. Atenção aos sinais de má alimentação e / ou beber e comportamento apático. Se a doré suspeita, fornecer Metacam cada 24 horas (mesma dose que no final de pós-cirurgia) até aliviado. A lidocaína pode ser aplicado localmente na ferida se o animal está se coçando ou apresenta sinais de desconforto. </li></ol> 6. Colocar o mouse sobre o cilindro e Formação (Figura 2G) <ol><li> Para colocar o mouse sobre o cilindro, conter o mouse com a mão brevemente, segurando-o pelo rabo com uma mão e, em seguida, segurando o mouse por trás dos ombros com o indicador e polegar com o outro. Enrole os dedos restantes ao redor do abdômen e tronco do mouse. </li><li> Com a mão não restringindo o mouse, conecte o conector para o capacete na cabeça do mouse e girar o parafuso de bloqueio. </li><li> Posicione o mouse suavemente no cilindro e segurá-la no lugar enquanto anexando o conector para o quadro. Use os dois parafusos para fixar o conector para as barras de cima do cilindro. </li><li> Uma vez que o conector tenha sido fixadas à estrutura do cilindro, release o domínio sobre o mouse. Dê o mouse de um dia duas sessões de habituação ao cilindro. Permitir que cada sessão de habituação a mesma duração que cada sessão condicionado. <ol><li> Ficha taxa de intermitência espontânea durante habituação e pré-expor os ratos para a vibração suiça CS, a fim de minimizar a ocorrência de respostas de alarme. Aplique o CS como durante uma sessão real condicionado, mas sem o choque eléctrico US. </li><li> Aplicar a estimulação whisker CS, colocando o sistema Piezo próximo (cerca de 0,5 cm) para o lado ar (do lado direito) do mouse, enquanto deslizando os dentes do pente sobre bigodes individuais. Certifique-se de que os mesmos bigodes são estimulados dia a dia, colocando o sistema Piezo na mesma posição de dia para dia. </li></ol></li><li> Começar a treinar o mouse sobre o condicionamento clássico. Entregar duas sessões de treinamento por dia durante cinco dias. Deixar cerca de duas horas entre cada sessão de treinamento. <ol><li> Para o grupo condicionado, deliver trinta ensaios por sessão de 250 ms de comprimento suiça vibração CS (60 Hz) emparelhado com um pulso elétrico 100 ms de comprimento EUA (0,3 mA - 3 mA, entregues a partir de um WPI A385R estímulo isolador). Separe o CS e os EUA com um ms longo intervalo de rastreamento 250 livre de estímulo para tornar a tarefa dependente do hipocampo (Figura 1) 23. </li><li> Ajustar a intensidade do choque eléctrico para cada animal, de modo que um piscar é evocado. ensaios separados com um intervalo inter aleatória de 30-60 segundos (média de 45 segundos, a duração total de 30 minutos por sessão.) </li><li> Deliver trinta CS desemparelhado isoladamente e nos sozinhos ensaios cada (para um total de sessenta ensaios) para o grupo pseudoconditioned, utilizando os mesmos parâmetros de estímulo como indicado para o grupo condicionado. Certifique-se de que o CS sozinho e US ensaios só são pseudorandomized tal que nenhum estímulo é apresentado mais de duas vezes consecutivas. Separe cada ensaio com um intervalo inter média de 22,5 seg. </li></ol></li><li> defígado ruído de fundo em 65 dB em toda a habituação e da formação, a fim de mascarar qualquer barulho da vibração gerada pelo estimulador triz. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+and+extracerebellar+involvement+in+mouse+eyeblink+conditioning:+the+ACDC+model.">Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model.</a> Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).</li><li>Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+kinetic+and+frequency-domain+properties+of+eyelid+responses+in+mice+with+magnetic+distance+measurement+technique.">Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique.</a> J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).</li><li>Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infragranular+barrel+cortex+activity+is+enhanced+with+learning.">Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning.</a> J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Classical eyeblink condicionado é uma forma de aprendizagem associativa que é uma ferramenta útil para a compreensão das bases neurais subjacentes à aprendizagem e memória. Os métodos anteriores empregues para o condicionamento de piscar de roedores, tais como ratinhos envolveu uma câmara que permitiu que o animal se mover livremente. A preparação fixa-cabeça para o condicionamento de piscar de ratinhos, usando o aparelho descrito por Chettih et ai. E Heiney et ai., E utilizados mais recente...

condicionado piscar de olhos é uma forma de condicionamento pavloviano e um sistema modelo para investigar os mecanismos neurais de aprendizagem associativa e memória. Tem sido investigada em várias espécies, incluindo humanos, coelhos, gatos, ratos e ratinhos. O paradigma envolve a apresentação de dois estímulos emparelhados: um estímulo neutro condicionado (CS; por exemplo, um tom, um flash de luz, ou a estimulação whisker), e um estímulo incondicionado saliente (US; por exemplo, um sopro de ar para o olho, ou choque periorbital). Os EUA provoca uma incondicionada, a resposta eyeblink reflexiva (ou seja, UR). Eventualmente, após várias apresentações do emparelhado CS-US, o sujeito aprende a associar o CS com os EUA. Essa aprendizagem se manifesta sob a forma de uma resposta condicionada (CR), um piscar de olhos provocada pelo CS sozinho que precede a apresentação de os EUA. condicionado piscar de olhos, sob a forma de rastreamento inclui um intervalo livre de estímulo de poucos hmilissegundos undred que separa o CS e os EUA (Figura 1). Traço condicionado é uma forma de aprendizado declarativo, uma vez que requer consciência das contingências de estímulo 1. O intervalo temporal que requer o animal a manter um neural &#39;trace&#39; do CS em regiões frontais do cérebro, como o hipocampo para que os EUA e a CS a associar-se 1-6. Juntamente com as regiões do cérebro anterior, o condicionamento é também dependente do cerebelo 7. condicionado Eyeblink é, portanto, um paradigma útil para a investigação das múltiplas facetas da memória, incluindo a aquisição, consolidação e recuperação. Durante o condicionamento piscar de olhos, um grupo de animais de controlo é apresentada com estímulos desemparelhados por ordem aleatória para testar pseudoconditioning ou sensibilizados respostas ao CS que podem ser causadas por apresentação só nos EUA, em vez de uma associação aprendido CS-US. Um appara utilizadatus para a investigação de condicionamento de piscar de roedores é uma câmara em que os roedores estão autorizados a circular livremente durante o processo de formação 8-10. Com este tipo de dispositivo, um cabo é normalmente ligado a um capacete que está afixado ao crânio do roedor. A corda permite a entrega de os EUA (e por vezes, a CS) e para transmitir a resposta do animal aos estímulos (ou seja, a resposta de piscar) 10. O cabo pode ele próprio ser modificado com base no tipo de estímulos entregues e como a resposta eyeblink é gravado. A razão para usar &quot;livremente em movimento&quot; ratos amarrados para o condicionamento eyeblink é que os ratos lutar contra contenção. Apesar de outras espécies podem ser mais receptivos a contenção, a grande vantagem de usar ratinhos em experimentos de condicionamento eyeblink é que a maioria das estirpes mutantes geneticamente modificados estão disponíveis estirpes de ratinho. Além lutam, res completostraint de ratos resulta em sofrimento agudo. Uma preparação rato fixo-cabeça que minimiza o stress aumentaria a informação fisiológica que pode ser obtida durante o condicionamento piscar de olhos. Por exemplo, este sistema permitiria imagens de neurônios corticais com microscopia de dois fótons de 11. Preparações fixo de cabeça têm sido usados ​​em experiências anteriores para imagiologia óptica do córtex através de implantes cranianos removíveis, in vivo registos electrofisiolicos do cérebro de roedores com matrizes tetrode, imagem de cálcio de dois fotões, e também como uma plataforma para o condicionamento de piscar de ratinhos 11 -16. No sistema fixo-cabeça, estimulação e gravações de confiança são assegurados sem restrição completa do mouse (Figura 2). Um capacete como o usado no sistema movendo-se livremente é afixada ao crânio do mouse. Durante o treinamento, o capacete é afixada a um conector que está ligado a bares maisuma esteira cilíndrica, a fim de estabilizar a cabeça do roedor (Figura 2A). A esteira cilíndrica permite que o mouse para descansar confortavelmente, mas se o mouse assim o desejar, também permite que ele seja executado ou a andar. Com a utilização deste sistema, os ratos podem ser formados com uma vibração suiça como o CS e um choque eléctrico suave periorbital como os EUA (Figura 1). Os EUA é entregue através de fios cirurgicamente colocado debaixo da pele lateral, para o olho. O CS é entregue através de um pente que é ligado a um actuador 2-camada flexão rectangular (Figura 2B). O pente e flexão do actuador são, então, ligado a uma base magnética que é movido para a posição adequada durante o treino, e é ajustada para entrega ideal para cada animal individual. O pente está posicionada para escarranchar os bigodes selecionados. Durante a entrega do CS, é enviado um sinal para o actuador de flexão que desloca o pente e leva a vibração dos bigodes 17. 16,18,19. A estimulação suiça razão é escolhida para o CS neste paradigma experimental, é a dependência de animais de murino na sua vibrissas para a entrada de informação somatossensorial durante a exploração. Estimulação suiça foi demonstrado ser um fiável e eficaz CS 20. Além disso, dado o substrato cortical bem estabelecida e organizada do sistema vibrissae (ou seja, o córtex barril), a estimulação suiça como o CS fornece uma ferramenta elegante para mapear alterações corticais e plasticidade associados com a aprendizagem eyeblink condicionado 20,21. Um sistema fixo-cabeça permite a estimulação precisa de bigodes selecionados para comparar as respostas entre os neurônios e neurônios que recebem entradas de bigodes não estimuladas estimuladas. Finalmente, muitas linhagens de camundongos apresentam perda auditiva relacionada à idade como adultos relativamente jovens <sup&gt; 22, e fechamento das pálpebras durante o piscar condicionado altera a CS visual (embora um CS visuais faz melhorar questões com respostas de sobressalto 16). suiça estimulação não é afectada por qualquer uma destas complicações. Aqui apresentados são modificações únicas e importantes sobre outras preparações fixo-cabeça para o condicionamento piscar de olhos, incluindo métodos de entrega CS e US, bem como a aquisição da resposta eyeblink. A confiabilidade deste aparelho eo paradigma de formação no condicionamento eyeblink é demonstrado pelas curvas de ratos condicionados e uma curva de aprendizagem relativamente plana de animais de controle pseudoconditioned (Figura 7A) de aprendizagem.

<table><tbody><tr><td>Exervo TeraNova Foam Roller 36&quot; x 6&quot;&amp;nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B002ONUM0E</td><td>For cylinder</td></tr><tr><td>Plexiglas</td><td></td><td></td><td>Custom-made; 1 cm thick</td></tr><tr><td>Metal Rods (12.7&amp;nbsp;mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>4-40 machine screw (.25&amp;nbsp;in. long)</td><td>Amazon Supply</td><td>B00F33Q8QO</td><td>For cylinder</td></tr><tr><td>Classic Design Hair Comb</td><td>Conair</td><td>93505WG-320</td><td>For whisker stimulation</td></tr><tr><td>2-Layer Rectangular Bending Actuator</td><td>Piezo Systems</td><td>T220-A4-303X&amp;nbsp;</td><td>For whisker stimulation</td></tr><tr><td>Solder and Flux Kit</td><td>Piezo Systems</td><td>MSF-003-NI</td><td>For whisker stimulation</td></tr><tr><td>Magnetic Base</td><td>Thor Labs</td><td>MB175</td><td>For whisker stimulation</td></tr><tr><td>Threaded rod for magnetic base</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp.</td><td></td><td></td><td>Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008</td></tr><tr><td>TO-220 Style Transistor</td><td>Amazon Supply</td><td>B0002ZPZYO&amp;nbsp;</td><td>For connector; for the wings</td></tr><tr><td>Relia-Tac Sockets</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-S02</td><td>For connector</td></tr><tr><td>Relia-Tac Pins</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-P02</td><td>For headpiece</td></tr><tr><td>0-80 stainless steel machine screw (1 in. long)</td><td>Amazon Supply</td><td>B000FN68EE</td><td>Locking Screw</td></tr><tr><td>0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick)</td><td>Amazon Supply</td><td>B000N2TK7Y</td><td>Locking Screw Head</td></tr><tr><td>Loctite Super Glue-Liquid</td><td>Loctite</td><td>1365896</td><td>Cyanoacrylic glue; for the locking screw</td></tr><tr><td>Quick Setting Epoxy</td><td>Ace Hardware</td><td>18613</td><td>For connector and whisker stimulation system</td></tr><tr><td>Ethernet Cable Wires</td><td></td><td></td><td>Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector</td></tr><tr><td>Polyimide coated stainless steel wires (2&amp;nbsp;in. long, .005 in. diameter)</td><td>PlasticsOne</td><td>005sw/2.0 37365 S-S&amp;nbsp;</td><td>For headpiece, EMG and shock wires</td></tr><tr><td>Stainless steel uncoated wire (.005&amp;nbsp;in. diameter)</td><td>AM Systems</td><td>792800</td><td>For headpiece, ground wires</td></tr><tr><td>Tenma Variable Autotransformer</td><td>Tenma</td><td>72-110</td><td>For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>1700</td><td>Amplifier for filtering and amplifying EMG signals</td></tr><tr><td>WPI A385R stimulus isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>31405</td><td>For the electrical shock</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)</td><td>Henry Schein: Animal Health</td><td>50031</td><td>For surgery; anesthesia</td></tr><tr><td>Buprenex Injectable CIII</td><td>Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>For surgery; analgesic</td></tr><tr><td>Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia</td></tr><tr><td>Povidine-Iodine Prep Pads</td><td>PDI</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td>For surgery; antiseptic</td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td></td><td></td><td>May be purchased from any standard pharmacy</td></tr><tr><td>Stainless steel surgical scalpel handles (no.3)</td><td>Integra Miltex&amp;nbsp;</td><td>4-7.</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Stainless steel surgical scalpel blades</td><td>Integra Miltex</td><td>4-310 or 4-315</td><td>For surgery; number 10 or 15 scalpel blade</td></tr><tr><td>3% Hydrogen Peroxide</td><td></td><td></td><td>May be purchased from any standard pharmacy</td></tr><tr><td>Micro Clip</td><td>Roboz</td><td>RS-5459</td><td>For surgery, to hold back skin</td></tr><tr><td>00-90 stainless steel machine screw (0.0625&amp;nbsp;in. long)</td><td>Amazon Supply</td><td>B002SG89X4&amp;nbsp;</td><td>For surgery, to wrap ground wire around</td></tr><tr><td>Professional Rotary Tool</td><td>Walnut Hollow</td><td>29637</td><td>Hand drill for surgery, to drill holes in skull</td></tr><tr><td>Inverted Cone Burr</td><td>Roboz</td><td>RS-6282C-34</td><td>Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull</td></tr><tr><td>Engraving Cutter Drill Bit</td><td>Dremel</td><td>106</td><td>Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond-Quick! Cement System &quot;B&quot; Quick Base</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder</td><td>Parkell</td><td>S399</td><td>For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond-Quick! Cement System &quot;C&quot; Universal TBB Catalyst 0.7 ml</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip</td><td>Parkell</td><td>S387</td><td>For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion</td></tr><tr><td>Swiss Tweezers, style #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504506</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Puritan Cotton-Tipped Applicators</td><td>VWR International</td><td>10806-005&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Dental Caulk Grip Cement Kit</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>For surgery; dental cement</td></tr></tbody></table>

whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed mice

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse's head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.

8-10 semana do sexo masculino de idade ratinhos C57BL6 / J foram treinados sobre trace eyeblink condicionado no aparelho esteira cilíndrico fixo-cabeça. 8 ratos foram treinados com apresentações emparelhadas CS-americanos (grupo condicionado) e 9 ratos foram treinados com apresentações CS e US desemparelhados (grupo pseudoconditioned). Exemplo EMG gravações de uma resposta condicionada de um ratinho condicionados são ...

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Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.

sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

whisker-signaled-eyeblink-classical-conditioning-in-head-fixed-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

12.9K visualizações.  Northwestern University. The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.

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Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Comportamento

Classical Short-Delay Eyeblink Conditioning in One-Year-Old Children

Classical eyeblink conditioning (EBC) refers to the learned association between a conditioned stimulus (an auditory tone) and an unconditioned stimulus (a puff of air to the cornea). Eyeblink conditioning is often used experimentally to detect abnormalities in cerebellar-dependent learning and memory that underlies this type of associative learning. While experiments in adults and older children are relatively simple to administer using commercial equipment, eyeblink conditioning in infants is more challenging due to their poor compliance, which makes correct positioning of the equipment difficult. To achieve conditioning in one-year-old infants, a custom-made or an adapted commercial system can be used to deliver the air puff to the infant's cornea. The main challenge lies in successfully detecting and classifying the behavioral responses. We report that automated blink detection methods are unreliable in this population, and that conditioning experiments should be analyzed using frame-by-frame analysis of supplementary video camera recordings. This method can be applied to study developmental changes in eyeblink conditioning and to examine whether this paradigm can detect children with neurological disorders.

This protocol describes an eyeblink conditioning paradigm appropriate for experiments with one-year-old infants. Commercial or custom-made equipment can be used to deliver the stimuli, and data collection and analysis should be performed on the video recordings.

Condicionamento clássico curto-atraso Eyeblink em crianças de um ano de idade

Classical eyeblink conditioning (EBC) refers to the learned association between a conditioned stimulus (an auditory tone) and an unconditioned stimulus (a ...

A System for Tracking the Dynamics of Social Preference Behavior in Small Rodents

Exploring the neurobiological mechanisms of social behavior requires behavioral tests that can be applied to animal models in an unbiased and observer-independent manner. Since the beginning of the millennium, the three-chamber test has been widely used as a standard paradigm to evaluate sociability (social preference) and social novelty preference in small rodents. However, this test suffers from multiple limitations, including its dependence on spatial navigation and negligence of behavioral dynamics. Presented and validated here is a novel experimental system that offers an alternative to the three-chamber test, while also solving some of its caveats. The system requires a simple and affordable experimental apparatus and publicly available open-source analysis system, which automatically measures and analyzes multiple behavioral parameters at individual and population levels. It allows detailed analysis of the behavioral dynamics of small rodents during any social discrimination test. We demonstrate the efficiency of the system in analyzing the dynamics of social behavior during the social preference and social novelty preference tests as performed by adult male mice and rats. Moreover, we validate the ability of the system to reveal modified dynamics of social behavior in rodents following manipulations such as whisker trimming. Thus, the system allows for rigorous investigation of social behavior and dynamics in small rodent models and supports more accurate comparisons between strains, conditions, and treatments.

Described here is a novel automated experimental system that offers an alternative to the three-chamber test and also solves several caveats. This system supplies multiple behavioral parameters that enable rigorous analysis of small rodent behavioral dynamics during the social preference and social novelty preference tests.

Um sistema para acompanhar a dinâmica do comportamento de preferência social em pequenos roedores

Exploring the neurobiological mechanisms of social behavior requires behavioral tests that can be applied to animal models in an unbiased and ...

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as photophobia. Whilst it is impossible to confirm that a mouse is experiencing migraine, light aversion can be used as a behavioral surrogate for the migraine symptom of photophobia. To test for light aversion, we utilize the light/dark assay to measure the time mice freely choose to spend in either a light or dark environment. The assay has been refined by introducing two critical modifications: pre-exposures to the chamber prior to running the test procedure and adjustable chamber lighting, permitting the use of a range of light intensities from 55 lux to 27,000 lux. Because the choice to spend more time in the dark is also indicative of anxiety, we also utilize a light-independent anxiety test, the open field assay, to distinguish anxiety from light-aversive behavior. Here, we describe a modified test paradigm for the light/dark and open field assays. The application of these assays is described for intraperitoneal injection of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in two mouse strains and for optogenetic brain stimulation studies.

Rodents are not able to report migraine symptoms. Here, we describe a manageable test paradigm (light/dark and open field assays) to measure light aversion, one of the most common and bothersome symptoms in patients with migraines.

Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Neurociência

Behavioral Training Procedures for Head-fixed Virtual Reality in Mice

Virtual reality (VR) combined with head-fixation is increasingly being utilized in behavioral neuroscience studies as it allows complex behavioral assays to be performed in head-fixed mice. This enables precise behavioral recordings while incorporating various neurophysiological techniques that require head-fixation to minimize movement-related signal noise during neural recordings. However, despite the growing use of VR, there is little published data on the detailed methodology of how to implement it. In this study, a training protocol is developed whereby male and female C57B16/J mice are trained to run down a virtual linear corridor, the length of which is increased from 1-3 m over multiple training sessions. Building upon this foundation, this study investigated the feasibility of mice performing complex behaviors within VR using a Y-maze paradigm. The task required navigating to the arm with black walls from the choice point in the Y-maze. After reaching a criterion of two consecutive days equal to or greater than 70% correct, the mice progressed to increasingly difficult sensory discrimination. The findings provide important details on the methodologies useful for the successful training of mice in VR and demonstrate that mice exhibit learning capabilities in navigating the Y-maze. The methodology presented not only offers insights into training duration in VR-based assays but also underscores the potential for probing intricate behaviors in mice, opening avenues for more comprehensive neuroscience investigations.

The article describes the experimental procedures for the commonly used linear track virtual reality (VR) paradigm in mice as well as determining the feasibility of running complex VR tasks by testing a Y-shaped signal discrimination task.

Virtual reality (VR) combined with head-fixation is increasingly being utilized in behavioral neuroscience studies as it allows complex behavioral assays ...

<meta charset="utf8"></head><body>Detecção de estrabismo do olho do mouse em tempo real para rastreamento da dor da enxaqueca usando o DeepLabCut

An Automated Squint Method for Time-syncing Behavior and Brain Dynamics in Mouse Pain Studies

Spontaneous pain has been challenging to track in real time and quantify in a way that prevents human bias. This is especially true for metrics of head pain, as in disorders such as migraine. Eye squint has emerged as a continuous variable metric that can be measured over time and is effective for predicting pain states in such assays. This paper provides a protocol for the use of DeepLabCut (DLC) to automate and quantify eye squint (Euclidean distance between eyelids) in restrained mice with freely rotating head motions. This protocol enables unbiased quantification of eye squint to be paired with and compared directly against mechanistic measures such as neurophysiology. We provide an assessment of AI training parameters necessary for achieving success as defined by discriminating squint and non-squint periods. We demonstrate an ability to reliably track and differentiate squint in a CGRP-induced migraine-like phenotype at a sub second resolution.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: decifrando redes elétricas por trás de atividades e distúrbios cerebrais complexos

This protocol provides a method for tracking automated eye squint in rodents over time in a manner compatible with time-locking to neurophysiological measures. This protocol is expected to be useful to researchers studying mechanisms of pain disorders such as migraine.

Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

Spontaneous pain has been challenging to track in real time and quantify in a way that prevents human bias. This is especially true for metrics of head ...

Assessing Rodent Empathy: Observational Fear and Vicarious Freezing Method

Observational Fear as a Model of Affective Empathy in Mice

Empathy, characterized by the ability to recognize and share the emotions of others, plays a fundamental role in shaping social interactions. It allows individuals to respond to the emotional states of others, promoting prosocial behaviors and social bonding. Observational fear is a fundamental aspect of affective empathy, where an observer witnesses a demonstrator undergoing aversive experiences and subsequently exhibits fear behaviors. This socially induced vicarious freezing response in observers, known as emotional contagion or affect sharing, is regarded as an indicator of empathy-like traits in rodents. Here, we present a protocol that delineates the assessment of vicarious freezing responses in observers exposed to conspecific demonstrators receiving aversive foot shocks. The utilization of observational fear assays in rodents has become a widely adopted method for studying the neural mechanisms underlying affective empathy. Given the universality of observational fear across mammals, this methodology further contributes to advancing our understanding of the neural substrates of empathy in humans.

The observational fear paradigm assesses vicarious freezing in rodents as a model for affective empathy. This procedure entails exposing observer rodents to conspecific demonstrators receiving aversive foot shocks to elicit empathic freezing responses. By employing observational fear assays, researchers can investigate the neural mechanisms underlying affective empathy.

Empathy, characterized by the ability to recognize and share the emotions of others, plays a fundamental role in shaping social interactions. It allows ...

sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

Resumo

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Condicionamento clássico curto-atraso Eyeblink em crianças de um ano de idade

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Behavioral Training Procedures for Head-fixed Virtual Reality in Mice

Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

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Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

Observational Fear as a Model of Affective Empathy in Mice