We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Protocolos experimentais foram realizados em ratos fêmeas Long Evans (250-350 g), em conformidade com as orientações de cuidados de animais e utilização federal prescritos e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Califórnia em San Diego. 1. Acclimating do Rato para o Corpo Restraint NOTA: Coloque o rato em uma dieta restrita. Alimente o rato uma vez por dia, imediatamente após cada sessão de manejo diário para aclimatar o rato para o sistema de retenção (descrito abaixo). Fornecer alimentação suficiente para manter o animal em 80% do seu peso inicial. Este montante é de aproximadamente 6 gramas de ração por dia para um 250 g feminino longo Evans rato. <ol><li> Aclimatar o rato a ser manuseados por humanos. Gentilmente conter o rato com a mão por períodos de cerca de 5 segundos a cada 30 seg. Faça isso por 15 min por dia em dois dias consecutivos. Monitorar os ratos diariamente para sinais de estresse durante o período de treinamento. Os sinais incluem lutando in resposta à contenção, vocalização e dente-vibração. </li><li> No dia 3 rd, colocar o rato em uma peúga pano de restrição do corpo (Figura 1), durante 15 minutos por dia em dois dias consecutivos. </li><li> No 5º dia, colocar o rato dentro da meia, e colocar a meia no interior de um tubo rígido no jig experimental (Figura 4). Deixe o rato no tubo durante 15 min por dia em dois dias consecutivos. </li><li> Alimente o rato imediatamente após cada sessão de treino. No final da última sessão (6 ° dia) dar acesso restrito ao alimento. Selecione para implantação apenas os ratos que não mostram sinais de estresse excessivo no último dia de treinamento. NOTA: Embora selecção de ratos para implantação é subjectiva, nas nossas mãos, mais de 90% dos ratos foram encontrados para ser responsivo a habituação e capaz de se submeter a implantação. </li></ol> 2. Implantação do Mecanismo de gravação Câmara e dos apoios de cabeça <ol><li> Adicione uma refio Conferência soldando fios de aço inoxidável nua para um conector de pino. Corte o fio de modo que 3-5 mm restos descobertos pelo pino. Autoclave o fio de referência, juntamente com todos os instrumentos cirúrgicos. </li><li> Administrar cetamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de cetamina misturados com 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente. A dose inicial dura 1½ a 2 horas. Suplemento da anestesia cada 30-45 min depois disso, quando necessário. Lubrificar os olhos do animal com uma pomada oftálmica. </li><li> Verifique o reflexo de retirada do dedo do pé para determinar o plano de anestesia, e manter a anestesia, se necessário. </li><li> Coloque o rato em uma armação de retenção estereotáxica com barras de ouvido (Figura 3A). Raspar o cabelo na cabeça e desinfectar o local do ferimento com iodopovidona (solução a 10%). Tome cuidado para inserir as barras de ouvido de forma apropriada para que eles não danificar o tímpano. Barras de ouvido com pontas contundentes são preferíveis. </li><li> Faça uma incisão com um bisturi aproximadamente ao longo da linha média do crânio a partir do nível rostro-caudal dos olhos para a parte de trás das orelhas. Utilize uma tesoura para cortar e remover uma tira de 2-3 mm de pele em ambos os lados da incisão. </li><li> Raspe o periósteo para expor a superfície do crânio até as nervuras laterais. Cubra o crânio exposto com fina camada de supercola. </li><li> Faça um furo pequeno, com um diâmetro ligeiramente menor do que 0-80 parafusos, usando uma broca burr ½ mm de diâmetro (ver secção de Materiais). Perfurar o furo imediatamente posterior ao bregma, onde a sutura se encontra com o cume lateral, e a um ângulo de 30-45 ° na cavidade craniana, de modo que o parafuso pode entrar com o topo mais lateral do que o fundo. </li><li> Parafuso em um parafuso 0-80 máquina de fundo plano para o buraco (aproximadamente 3 voltas), a 30-45 ° ângulo. Tenha cuidado para não enroscar muito profundamente para evitar danificar o tecido cerebral subjacente. </li><li> Repetir este procedimento para 6 parafusos adicionais na configuração mostrada <strong&gt; (Figura 3B). Aplicar supercola para a base de todos os parafusos. </li><li> Coloque uma agulha da seringa no manipulador stereotax. Medida a partir da sutura bregma, e fazer um dente no crânio com a agulha perto, mas fora do local de craniotomia desejado, como uma marca de referência. NOTA: Nesta demonstração, as coordenadas estereotáxica da marca são de 3 mm posterior e 1 mm de laterais à sutura bregma. </li><li> Marque o dente com um marcador permanente. Observe as coordenadas estereotáxica da marca, uma vez que irá servir como um ponto de referência estereotáxico (Figura 3B). </li><li> Adicione uma craniotomia centrada nas coordenadas desejadas (de 3 mm posterior e 3 mm lateral ao bregma, neste exemplo). Deixar a dura-máter intacta. Cobrir a craniotomia com fluido cerebrospinal artificial modificado (NaCl 125 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Corte um tubo de 0,2 ml de centrífuga de 4-5 mm de comprimento, e cortou a tampa. Colocar o tubo no crânio e centralizá-lo sobre a craniotomia. </li><li> Aplicar cimento dentário em torno da parte inferior do tubo, para vedar a base do tubo para o crânio. Tenha cuidado para não vazar cimento na craniotomia exposta (Figura 3D). </li><li> Perfurar um outro furo pequeno (cerca de ½ mm de diâmetro) na placa cranial contralateral e insira cuidadosamente o fio de referência. Construir o fio de soldar de referência por um pino que serve de interface com o amplificador de gravação para a extremidade do fio (ver secção Equipamento). Não mova o fio de referência, uma vez que está no cérebro, pois isso pode causar danos. </li><li> Aplicar supercola para o orifício em que o fio foi inserido. Isto irá selar o pino e fio no lugar temporariamente. </li><li> Misturar as duas partes do kit de gel de silicone (ver secção de Materiais) em porções aproximadamente iguais. Aguarde dois minutos para misturar e fill do tubo de centrifugação aproximadamente ⅓ completa com gel. </li><li> Anexar um direito braçadeira pós ângulo (ver secção de materiais) para a barra de apoio de cabeça. Fixar a placa de cabeça (Figura 2A) para a barra de retenção (Figura 2B) a um ângulo de 45 ° passo de modo que o fundo da placa está voltada para o nariz do animal. É útil utilizar um ângulo de inclinação para o ângulo de inclinação definido para coincidir com o dispositivo de montagem experimental (Figura 4). </li><li> Fixe o bar exploração para o braço stereotax manipulador para que a barra é paralela às barras de ouvido. Abaixe a barra e placa para que o prato é posterior da sutura lambda e anterior ao caudal-mais parafuso. </li><li> Segure a cabeça do parafuso da frente (8-32 um perno ou parafuso, consulte a secção de Materiais) a cerca de 45 ° de ângulo com um braço e mãos braçadeira de ajudar, de modo que a cabeça do parafuso está voltado para baixo e para a cauda do animal. Abaixe o parafuso para que ele toque a formigaerior 0-80 parafusos (Figura 3F, G). </li><li> Fixe o parafuso e placa no local com acrílico dental. Aplicar acrílico dental em torno das cabeças dos parafusos de osso, pinos de referência, e em torno dos lados do tubo de centrifugação. Espera aproximadamente 10 min para o acrílico dental para secar (Figura 3H). </li><li> Aplicar uma camada de cimento dentário em torno das bordas do acrílico dental, solidificando a pele para o implante. Aguarde até que o cimento secar. </li><li> Pique vários furos na tampa do tubo de centrifugação, e coloque a tampa sobre o tubo. </li><li> Retire a ajudar as mãos grampo. Em seguida, retire cuidadosamente o bar-segurando a cabeça do stereotax, e, em seguida, retire a placa de cabeça a partir da barra (Figura 3I). </li><li> Retirar o animal da stereotax e administrar cuidados pós-operatórios e controlo, em conformidade com todas as regras, regulamentos e leis aplicáveis ​​(por exemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, a cada 8-12 horas para um mínimo de 24h). Se a inflamação se desenvolve em torno das bordas do implante, aplica uma camada fina de pomada antibiótica ao local afectado diariamente até resolvido. </li></ol> 3. Monitoramento Juxtacellular de Unidades Neuronal <ol><li> Puxar quartzo tubo capilar sobre uma micropipeta laser de dióxido de carbono puxador (ver secção Equipment) com diâmetros de ponta inferior a 1 mm (Figura 5A). NOTA: os parâmetros de aquecimento irá variar de acordo com o instrumento em particular, e que o diâmetro do pescoço requerida irá variar dependendo da estrutura do cérebro de interesse. Para gravações em tálamo rato, micropipetas têm pescoços vão 5-7 mm. </li><li> Fixe a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), equipado com objetivos longa distância de trabalho. Use massa de modelar para segurar a pipeta no lugar no palco do microscópio. </li><li> Mover-se lentamente um bloco de vidro (0,5-1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para making facas ultra micrótomo é conveniente) para dentro do campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador fase, tocar suavemente a ponta da pipeta para o vidro, quebrá-la. Repita quantas vezes for necessário até que o diâmetro externo da ponteira é entre 1-3 mm (Figura 5B, C). Certifique-se de que estes micropipettes têm impedâncias entre aproximadamente 5-15 mohms. </li><li> Preparar solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 com NaOH) e adicionar 2 8% (w / v) de Chicago céu azul. Usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menor, preencher a extremidade traseira da pipeta com a solução. Alternativamente, para rotulagem juxtacellular célula única adicionar 2% (w / v) Neurobiotin ou amina dextrano biotinilado (BDA-3000 ou BDA-10000) para a solução salina em vez de Chicago céu azul. </li><li> Coloque o rato dentro da meia pano dentro do tubo rígido em um jig experimental adequado ( <strong&gt; Figura 4) .Wait um mínimo de 72 horas após a cirurgia, antes de colocar o animal no gabarito dos apoios de cabeça. Apertar o cordão em torno do esterno superior, ao invés do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parece ser trabalhado ou obstruída, solte o cordão ou movê-lo posteriormente. Realizar este procedimento enquanto o rato está alerta. </li><li> Fixar a placa de cabeça-de restrição sobre o rato para a peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro pino da placa dos apoios de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-o com um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal é calma, a fim de evitar a aplicação de força excessiva na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que é implantado no rato. Então parafuso em uma haste de aço inoxidável com rosca para a cabeça do parafuso. Apor a haste para o dispositivo de montagem experimental, de tal forma que ele pode ser apertado no lugar (Figura 4). NOTA: Protegendo o animal com a cabeça do parafuso, bem como o dos apoios de cabeça placa minimizes flexão do aparelho de gravação e melhora a estabilidade. Na maioria dos casos a gravação poderá ser iniciada no primeiro dia o animal está contido-cabeça. No entanto, se o animal fidgets excessivamente ou vocaliza, proporcionar um dia de treinamento de habituação dos apoios de cabeça antes de começar qualquer gravação. Neste caso, deixe o animal no gabarito durante 15 minutos e, em seguida, colocá-lo de volta em sua gaiola. Repita este passo o dia seguinte e continuar com o protocolo. </li><li> Abra a câmara de gravação e retire o gel de silicone. Limpe a craniotomia usando uma pinça fina se o tecido tem re-cultivadas na craniotomia. </li><li> Fixe a pipeta para o micromanipulator motorizado, e conecte o headstage pré-amplificador. NOTA: No presente demonstração, um pequeno circuito de relé da headstage é usado para alternar entre os fios amplificador de chumbo e uma fonte de corrente externa com alta conformidade (Figura 6A-C). Note que alguns amplificadores têm um adequado built-in fonte cumprimento alta(Ver secções de discussão e de Materiais). </li><li> Usar o micromanipulador motorizado para deslocar a ponta da pipeta para a marca estereotáxicamente identificado na câmara de gravação. Observe as coordenadas desse local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio. </li><li> Mova a pipeta para o local de gravação desejado nos eixos ântero-posterior e médio-lateral. Em seguida, avançar o ventralmente pipeta através da dura até que ele é de aproximadamente 500 mm dorsal para o local de gravação pretendida. </li><li> Avance lentamente a pipeta enquanto escuta para spiking eventos em um monitor de áudio da tensão amplificada gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez que eventos spiking são identificados, continuam a mover-se a pipeta de 0-100 mm até desvios positivos de tensão vai superiores a cerca de 500 mV são observados. NOTA: A resistência do eletrodo vai aumentar em um fator de aproximadamente 1,5-10 when esta ocorre. </li><li> Começar a gravar uma vez por unidade foi isolado como segundo passo 3.11, junto com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. No presente demonstração, movimentos Vibrissa auto-geradas são monitorados com videografia de alta velocidade (ver secção de Materiais). </li><li> Para marcar o local de gravação, mude o eletrodo leva para se conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relê (Figura 6A - C), um built-in fonte de corrente no amplificador, ou manualmente (Figura 6D, veja o passo 3.8 e Discussão). Passe -4 mA com 2 pulsos seg a 50% ciclo de trabalho para 4 min para injetar iontoforéticamente Chicago céu azul através da pipeta. </li><li> Matar e aspergir o animal depois de vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática habitual. Seção do cérebro e counterstain como necessários para identificar a localização anatômica da gravação sentare. Contracorante o tecido para o citocromo-oxidase reatividade como por 14. Alternativamente, identificar os depósitos Chicago Sky azuis usando microscopia de fluorescência. NOTA: Para diferenciar com precisão entre as diferentes unidades etiquetadas, é importante que todos os rótulos são feitos com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desclampeamento a pipeta entre as etiquetas. Neste caso, locais de gravação podem ser diferenciados por suas localizações relativas em histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador notáveis ​​de cada local (veja o passo 3.9). Para a identificação inequívoca, marcar os rótulos, pelo menos, 200 mm separados um do outro, e não mais de 3-5 etiquetas por região do cérebro. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A construção do gabarito experimental A descrição dos componentes mecânicos utilizados para construir o dispositivo de montagem experimental (Figura 4) é omitida a partir do protocolo, uma vez que pode ser construído numa variedade de maneiras. Neste padrão demonstração opto-mecânico peças e braçadeiras de apoio são usados ​​para montar o bar apoio de cabeça e do tubo de retenção corporal (ver secção de Materiais)...

Monitorando a atividade neuronal em um animal alerta ativamente engajados em uma tarefa comportamental é fundamental para a compreensão da função e organização do sistema nervoso. Gravação extracelular da atividade elétrica das unidades neuronais individuais tem sido um instrumento básico da neurociência sistemas e ainda é amplamente em uso no momento. Uma variedade de tipos de eletrodos e configurações estão disponíveis, dependendo das exigências científicas e técnicas de uma experiência particular. Cronicamente implantado microdrives ou conjuntos de eléctrodos são frequentemente utilizados em animais que se deslocam livremente, incluindo aves, roedores e primatas não-humanos 1-4. Alternativamente, penetrações agudos com metal ou vidro microeletrodos através de um micromanipulator externa são frequentemente usados ​​para gravar a partir de animais anestesiados ou restringido-cabeça. Eléctrodos de micropipeta de vidro tem a vantagem de que eles podem ser usados ​​na juxtacellular ou &quot;célula ligada&quot; configuração de isolar de forma inequívoca oatividade de neurônios individuais sem as complicações de pico post-hoc de classificação 5. Estes eléctrodos permitem gravar mais a partir de células ou locais identificados-anatomicamente, como elas podem ser usadas para injectar pequenos depósitos de corantes ou marcadores neuroanatómicos, ou ainda para preencher o indivíduo gravado célula. Esta configuração tem sido aplicado com sucesso em ratos, murganhos e aves 6-10. A técnica descrita atualmente se concentra em monitoramento juxtacellular e depósitos do corante extracelulares em alerta, ratos conteve-cabeça. Note-se que ao contrário única célula juxtacellular enche, esses depósitos de corante não fornecem informações sobre a morfologia celular ou projeções axonais 11, mas permitir a localização anatômica exata para cerca de 50 mm e, criticamente, têm um rendimento significativamente maior nos animais de alerta. Informações sobre unicelular juxtacellular enche não deixa de ser fornecido como uma estratégia alternativa para a rotulagem anatômica. Em breve, oprotocolo consiste em três grandes fases. Na primeira fase, o rato é aclimatados ao corpo de retenção de uma peúga pano (Figura 1) ao longo de um período de 6 dias. Na segunda fase, um aparelho de apoio de cabeça (Figura 2) e câmara de gravação são cirurgicamente implantado de modo a que o rato pode ser mantido no plano estereotáxica durante várias sessões de gravação subseqüentes (Figura 3); este procedimento permite que o experimentador para segmentar regiões sub-corticais específicas do cérebro para o estudo eletrofisiológico com base no padrão de referência de coordenadas 12. A terceira fase consiste em colocar o rato num gabarito adequado para a realização de experiências comportamentais e electrofisiológicos (Figura 4), ​​a construção do eléctrodo a partir de um tubo capilar de quartzo (Figura 5), fazer gravações neuronais juxtacellular inequivocamente que isolam as unidades individuais de 6-9, e marcando os locati anatômicasno do local de gravação com Chicago Sky azul corante (figuras 6 e 7). As gravações são realizadas com acompanhamento comportamental simultânea; no entanto, os detalhes técnicos do comportamento dependerá dos objetivos científicos de cada experiência e são, portanto, fora do âmbito de um protocolo único. Após a conclusão do procedimento experimental, o que pode ser repetido em vários dias, o animal é sacrificado. O cérebro é extraído e processado de acordo com as técnicas neuroanatomical padrão usando qualquer campo claro ou microscopia de fluorescência.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamine HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine solution)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidone-Iodine)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cyanoacrylate</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Grip cement powder</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>For the base of the recording chamber</td></tr><tr><td>Grip cement liquid</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>For the base of the recording chamber</td></tr><tr><td>Silicone gel</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet denture repair acrylic powder</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>For securing the head restraint apparatus to the cranium</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>For securing the head restraint apparatus to the cranium</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>For perfusion and tissue fixation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>For perfusion and tissue fixation</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>For cytochrome-oxidase staining, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>For cytochrome-oxidase staining, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rat sock</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 1, 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PVC tube 2 &amp;frac12;&amp;rdquo;</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>&lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Subminiature D pins &amp;amp; sockets</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stainless steel music wire 0.010&amp;rdquo; diameter</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic holding frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic ear bars</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;frac12; mm drill burr</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Quiet-Air dental drill</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel 0-80 &amp;frac18;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener superstore</td><td>247438</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.2 ml centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Custom head-holding bar</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Custom head-holding plate</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Right angle post-clamp</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>&lt;strong&gt;Figures 3, 4&lt;/strong&gt;; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (&lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;) are also from Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &amp;frac34;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>240181</td><td>For head-restraint, &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-40 &amp;frac14;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>239958</td><td>For head restraint, &lt;strong&gt;Figures 3, 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Quartz capillary tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>&lt;strong&gt;Figure 5&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Carbon dioxide laser puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Isolated pulse stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Pipette holder</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Alternate parts: see &lt;strong&gt;Discussion&lt;/strong&gt;, &lt;strong&gt;Figure 6A&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Electrode lead wire</td><td>Cooner wire</td><td>NEF34-1646</td><td>(optional), &lt;strong&gt;Figure 6D&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Relay for amplifier head-stage</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), &lt;strong&gt;Figure 6A-C&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Digital video camera</td><td>Basler</td><td>A602fm</td><td>(optional) For behavioral monitoring, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Unidades neuronais em ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar a fase de circulação vibrissa durante o auto-gerado mexendo 15,16. Figura 7A mostra a atividade spiking amostra de uma unidade thalamic VPM como um rato está mexendo ativamente. Figura 7B mostra um histograma de spike vezes alinhado à fase instantânea de vibrissa movimento 17. Há mais pontos durante a fase de retração de bater. Depois da gravação, o local da unidade foi marcado a...

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K visualizações.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Vídeo: Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Comportamento

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Neurociência

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents 

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different systemic challenges (pharmacological or physiological) to the CNS. For example, one can directly measure how the animal's midbrain dopamine projections respond to dopamine-releasing drugs like d-amphetamine or natural stimuli like food. In this video, we show you how to implant guide cannulas targeting specific sites in the rat brain, how to insert and implant a microdialysis probe and how to use high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-EC) to measure extracellular levels of oxidizable neurotransmitters and metabolites. Local precise introduction of drugs through the microdialysis probe allows for refined work on site specificity in a compound s mechanism of action. This technique has excellent anatomical and chemical resolution but only modest time resolution as microdialysis samples are usually processed every 20-30 minutes to ensure detectable neurotransmitter levels. Complementary ex vivo tools (i.e., slice and cell culture electrophysiology) can assist with monitoring real-time neurotransmission.

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents

The monitoring of extracellular neurotransmitter levels in distinct brain regions of freely moving animals offers insights on the link between neurotransmitter release and behavior. In vivo microdialysis coupled with electrochemical detection provides excellent anatomical and chemical resolution; and information on how basal neurotransmission is altered by pharmacological or physiological manipulations.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different ...

Biologia

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Imagens multicamadas com microprisma em animais com cabeça fixa e em movimento livre

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for studying the structure, function, and plasticity of living brain tissues. In comparison to conventional electrophysiology, fluorescence microscopy can capture the neural activity as well as the morphology of the cells, enabling long-term recordings of the identified neuron populations at single-cell or subcellular resolution. However, high-resolution imaging typically requires a stable, head-fixed setup that restricts the movement of the animal, and the preparation of a flat surface of transparent glass allows visualization of neurons at one or more horizontal planes but is limited in studying the vertical processes running across different depths. Here, we describe a procedure to combine a head plate fixation and a microprism that gives multilayer and multimodal imaging. This surgical preparation not only gives access to the entire column of the mouse visual cortex but allows two-photon imaging in a head-fixed position and one-photon imaging in a freely moving paradigm. Using this approach, one can sample identified cell populations across different cortical layers, register their responses under head-fixed and freely moving states, and track the long-term changes over months. Thus, this method provides a comprehensive assay of the microcircuits, enabling direct comparison of neural activities evoked by well-controlled stimuli and under a natural behavioral paradigm.

Autor em destaque: Imagem comparativa da atividade neural em estados acordados e em movimento livre

When integrated with a head-plate and an optical design compatible with both single- and two-photon microscopes, the microprism lens presents a significant advantage in measuring neural responses in a vertical column under diverse conditions, including well-controlled experiments in head-fixed states or natural behavioral tasks in freely moving animals.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

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Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Multi-layer Cortical Ca

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

Agudo

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada