Este trabalho foi apoiado pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), células em movimento Cluster de Excelência (EXC 1003 - CIM), da Universidade de Muenster (a SB e SGM) e pela Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Agradecemos Heike Blum pelas excelentes ilustrações.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades locais (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, tierschutz; Recklinghausen, Alemanha&quot;) e realizada de acordo com a lei alemã de proteção animal. 1. Comentários gerais para rato Experimentos <ol><li> Realizar todos os experimentos com ratos, de acordo com as diretrizes do respectivo Comitê Institucional Animal Care e Uso. </li><li> Mantenha os ratos sob condições livres de patógenos e capacitá-los a ter acesso a alimentos e água ad libitum. </li><li> Use ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque as propriedades biológicas podem variar de acordo com idade e sexo. </li><li> Sempre que possível tentar reduzir, aperfeiçoar ou substituir experiências com animais. </li></ol> 2. Preparação do gradiente de Percoll <ol><li> Misturar 19 ml de 1x PBS com 1 ml de PBS 10x, 1 ml de FCS e 10 ml de Percoll. </li><li> Realize sterile filtração em um tubo de vidro (diâmetro de poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação de Meio endotélio celular e revestimento de placas de cultura celular <ol><li> Médio de células endoteliais: <ol><li> Preparação de 500 ml de meio de: (. Aprox 20%) Misturar 400 mL de meio DMEM (aprox. 80%) com 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 ug / ml; aproximadamente 0,05%), 0,5 ml de heparina (100 ul / ml; aprox. 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; aprox. 0,1%). Adicionar pyrumycin apenas por meio de cultura de células usados ​​nos primeiros 2 dias de cultura. </li><li> Efectuar a filtração estéril num tubo de vidro (diâmetro dos poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C. </li></ol></li><li> Revestimento de placas de cultura de célula: <ol><li> Para obter 1 ml de solução de revestimento, se preparar uma solução de 500 ul ddH2O, 400 ul de colagénio IV (0,4 mg / ml) e 100 ul de fibronectina (0,1 mg / ml). </li><li> Cubra toda a superfície do each poço da placa de cultura de células com a solução de revestimento. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de células endoteliais microvasculares de Murino Cérebro (MBMEC) <ol><li> Sacrifício 10 ratinhos adultos (8-12 semanas de idade, C57BL / 6) por deslocamento cervical. Depois isolar os tapetes do cérebro e loja em 5 ml de PBS (Ressalva: Trabalho estéril). </li><li> Remover cérebro caules, cerebelo e tálamo com uma pinça. Retire meninges com cuidado rolando os cérebros em um papel mata-borrão estéril. Recolha os resultantes prosencï¿½alos meninges-livres. </li><li> Transferir os cérebros para um tubo Falcon de 50 ml cheia com 13,5 ml de DMEM. </li><li> Picar o tecido, primeiro com uma pipeta de 25 ml, em seguida, com uma pipeta de 10 mL até os meios de comunicação torna-se leitosa. </li><li> Em seguida, digerir o tecido com uma mistura de 0,6 ml de colagenase CLS2 (10 mg / ml em DMEM) e 0,2 ml de DNAse (1 mg / ml em PBS) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) durante 1 hora a 37 ° C em um orbital tremerr a 180 rpm. </li><li> Adicionar 10 ml de DMEM adicionado à suspensão de tecido e centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante (Ressalva: PELLET é fácil perder) </li><li> Para remover a mielina, ressuspender o sedimento com uma pipeta de 25 ml em 25 ml de DMEM-BSA (20% w / v) (aprox. 25 vezes), e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Descarte a camada de mielina superior (leitoso), com uma pipeta de Pasteur de vidro quebrado com diâmetro maior, e, em seguida, descartar a camada de BSA com uma pipeta Pasteur normal. </li><li> Ressuspender o sedimento em 9 ml de DMEM e adicionar 1 ml de colagenase / dispase (concentração final é de 1 mg / ml) e 0,1 ml de DNAse. Digerir a solução durante 1 hora a 37 ° C num agitador orbital a 180 rpm (ressalva: não utilize a pipeta para ressuspender - células podem ser perdidos). </li><li> Durante a digestão, centrifugar a solução de Percoll para definir-se o gradiente de densidade usando uma ultracentrífuga a 3.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, com aceleração, wifreio thout. </li><li> Adicionar 10 ml de DMEM para a suspensão de células digerido. Centrifugar a suspensão a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de DMEM. </li><li> Adicionar as células ressuspensas cuidadosamente no topo do gradiente de Percoll e centrifugar a 700 xg durante 10 min a 4 ° C sem aceleração e de travagem. Nota: As células são visíveis como uma nuvem na interfase. </li><li> Tome aprox. 12 ml da interfase com células com uma agulha estéril de comprimento e colocá-lo em um novo Falcon de 50 ml com 5 ml de DMEM. </li><li> Centrifuga-se as células novamente em 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida ressuspender o sedimento em meio de células endoteliais (use aprox. 0,2 ml de meio por 1 cm2 de superfície de placa de cultura celular). </li><li> Remover solução de revestimento de placas de cultura de células revestidas (veja o passo 3.2) e enxaguar bem com todos os PBS estéril em duas etapas de lavagem consecutivos. </li><li> Manter em culturas de células endoteliaismeio celular a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador estéril. Alterar o médio a cada 2-3 dias. Dividir células a 90% de confluência. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Disfunção hematoencefálica-barreira é uma característica de várias doenças deletérios do SNC, por exemplo, uma repartição do BBB na esclerose múltipla extensivamente facilita a invasão do SNC por células imunes auto-reativas e permite o encontro ea destruição de oligodendrócitos. No AVC isquêmico o rompimento do BBB e subsequente formação de edema cerebral são fatores críticos que influenciam o crescimento do infarto secundário ea sobrevida global dos pacientes 6. Além disso, por alterações da certificação em áreas remotas lesões isquémicas focais são capazes de induzir alterações funcionais generalizados do cérebro. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes são desconhecidos 5. Em contraste, a alta densidade e de diversidade de transportadores de efluxo em BMECs funcionais reduz a concentração de fármacos benéficos, tais como quimioterapêuticos para malignidades do cérebro ou antibióticos para doenças infecciosas. Portanto, uma compreensão mais profunda do cérebro-sangue-barrier função sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é necessária para desenvolver agentes farmacológicos que são capazes de regular especificamente a função de barreira na direcção favorecida 21. Confiável em modelos in vitro do BBB são ferramentas indispensáveis ​​para o estudo dos mecanismos de regulação do BBB. Muitas linhas de células endoteliais do cérebro imortalizados foram estabelecidos e utilizados como modelos in vitro do BBB 22. Estas linhas celulares oferecem certas vantagens sobre BMECs primários à medida que crescem mais rápido e manter certas características do BBB sobre diversas passagens. No entanto, as linhas de células endoteliais não pode substituir totalmente para células primárias como propriedades importantes são alterados que se misturam com a transferibilidade dos resultados experimentais para a situação in vivo. Por exemplo, a linha de células endoteliais de cérebro de murídeo bEnd.5 expressa apenas baixos níveis de proteínas de junções apertadas distribuídos descontinuamente que conduzem a alta pAraCpermeabilidade ellular 23. BEnd.3, outra linha de células endoteliais do cérebro murino frequentemente utilizado, demonstra junções densas e contínuas distribuídas apertados, uma alta resistência transendotelial, vários transportadores de efluxo e baixa permeabilidade paracelular. No entanto, as camadas de células em comparação com bEnd.3 BMECs primárias não possuem uma verdadeira discriminação no que diz respeito à permeação de certos substratos e transcelular paracelulares 24. Em preparações de culturas de células primárias, células contaminantes pode interferir significativamente com a validade dos resultados experimentais. No protocolo descrito, pyrumicin é usado como um agente selectivo para as células endoteliais para alcançar uma elevada pureza. No entanto, um controlo de qualidade regular da cultura de células é inevitavelmente necessário para garantir para experiências fiáveis. Existem vários métodos para o controlo de qualidade, além de propriedades morfológicas típicas de células endoteliais (ver Figura 1A), o transendothelial resistência pode ser medida, ou a expressão do marcador de célula endotelial, tais como CD31 (ver Figura 1B) ou factor de von Willebrand (vWF) pode ser avaliada. O número de células endoteliais cerebrais isoladas a partir de um cérebro de ratinho é relativamente baixo e para estabelecer uma cultura de células adequada para várias experiências, os cérebros dos vários ratos têm de ser reunidas. Na nossa experiência, no mínimo, 10 ratinhos necessitam de ser usado para um ensaio que pode ser um factor limitante, dependendo dos recursos da respectiva instalação para animais. Para evitar viés ou fatores de confusão, apenas camundongos com um fundo genético e ambiental idêntico deve ser agrupadas. Em contraste, bovina e preparações de células endoteliais de cérebro de suíno proporcionar um grande número de células endoteliais do cérebro disponíveis em um cérebro. No entanto, além da criação de simples e de habitação, o repertório amplo e cada vez maior de camundongos transgênicos disponíveis torna murino primário BMECs como um idealmodelo para estudar a função do sangue-cérebro-barreira. Várias descobertas-chave sobre as funções do BBB e os mecanismos moleculares subjacentes vieram de estudos em sistemas de cultura de tecidos em 2D. Recentemente, sistemas de cultura têm sido desenvolvidos 3D 25, onde as células endoteliais são colocados dentro de uma matriz de colagénio o que lhes permite formar lúmen e redes tubulares. Estes novos sistemas de cultura de células para permitir uma reprodução mais precisa dos processos vasculares no organismo intacto in vivo. O envolvimento de outras células dos NVU em 3D sistemas de cultura de células, tais como pericitos e astrócitos pode revolucionar a estudar in vitro da função sangue-cérebro-barreira; primeiros modelos foram desenvolvidos recentemente 26. Há algumas recomendações para a solução de problemas. Em primeiro lugar de trabalho estéril é essencial para a qualidade da cultura de células endoteliais. Em segundo lugar, pyrumycin só deve ser adicionado para celularmeio de cultura utilizado nos primeiros 2 dias de cultura, mais aplicação pode conduzir a um aumento da morte celular e MBMEC função de barreira baixa qualidade. Em terceiro lugar, as enzimas aplicadas neste protocolo deve ser utilizado e armazenado de acordo com as instruções do fabricante; caso contrário, sua função adequada pode ser comprometida. Além disso, o revestimento de placas de cultura de células pode ser alterado se as células endoteliais não atribuem. As concentrações de fibronectina e colagénio pode ser alterada ou outras proteínas de matriz pode ser adicionado à solução de revestimento. Por último, idade, sexo, estação do ano e condições ambientais dentro das instalações dos animais, são fatores importantes que podem influenciar a qualidade de MBMEC isolamento ea comparabilidade dos experimentos. Deve assegurar-se que as condições são comparáveis ​​entre experimentos independentes. O protocolo descrito deve ser considerado como um método básico para isolar neuroimunológicos BMECs murino. As células isoladas podem ser used para uma ampla variedade de aplicações para obter mais conhecimentos sobre a função BBB, tais como ensaios de migração, gene e estudos de expressão de proteínas, eletrofisiológica ou experimentos de permeabilidade. Como mencionado acima, 3D sistemas de cultura de células de BMECs pode proporcionar novas oportunidades para estudar os complexos mecanismos envolvidos na regulação da certificação no âmbito do NVU. Por isso, o isolamento de células endoteliais primárias permanecerá uma técnica valiosa no campo da investigação certificação no futuro.

<html> Microvascular cerebral células endoteliais (BMEC) formam monocamadas, que são parte integrante do sangue-cérebro-barreira altamente especializado (BBB). BMECs estão interligados por proteínas juncionais ligados a uma membrana basal. Juntamente com os pericitos, células musculares lisas, pés terminais astrocíticos e células sanguíneas circulantes formarem o chamado unidade neurovascular (NVU) 1. Contra o conceito anterior de uma barreira impermeável entre o sangue e o sistema nervoso-central (SNC), o NVU é uma interface dinâmica, altamente específica e regulado, que controla a passagem de fluidos, moléculas e células entre vasos sanguíneos cerebrais e do sistema nervoso central 2 . Uma disfunção ou desregulação do NVU podem iniciar e / ou contribuir para uma variedade de neuro-vasculares, doenças infecciosas, inflamatórias ou degenerativas do sistema nervoso central, tais como acidente vascular cerebral isquémico, HIV-encefalopatia, esclerose múltipla, doença de Parkinson ou de Alzheimer 3-6. _content &quot;&gt; A monocamada BMEC é hermeticamente fechado por um complexo juncional constituído de apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ) 7. A alta resistência elétrica ea baixa permeabilidade paracelular do BBB se baseiam principalmente nas proteínas TJ 8. Os TJs são complexos formados pelas proteínas transmembranares da família claudina e ocludina, que estão ligadas ao citoesqueleto das células endoteliais por moléculas adaptadoras, tais como os zonulaoccludens (ZO) proteínas ZO1-3 4. junções aderentes são montados, principalmente, pela proteína de membrana integral -cadherin vascular endotelial (VE), que está ligada ao citoesqueleto através cateninas 8. O fechamento hermético da certificação impede a livre troca de substratos e células entre o sangue e líquor. Exceções a essa regra são lipofílicos moléculas pequenas, com um peso molecular &lt;400 Da, que são capazes de atravessar a certificação por mediada por lipídios difusão 9. A passagem do maior e / oumoléculas hidrófilas, tais como a glucose, aminoácidos, péptidos, proteínas e diversos fármacos é limitada a sistemas altamente controladas de transporte transcelular 10, que podem ser classificadas em cinco categorias principais: transporte mediado por transportador, de transporte de iões, o transporte de efluxo activo, mediado por receptores transporte, e mediada por caveolae transporte 4. Estes sistemas de transportadores de ajudar a manter a homeostasia do sistema nervoso central, o que é necessário para a geração de um sinal preciso, transdução e integração. Além disso, BMECs são capazes de controlar activamente a transição de moléculas distintas pela expressão de uma variedade de ectoenzimas. Estas enzimas estão localizadas na superfície da célula e modificar os substratos endógenos e exógenos específicos impedindo ou permitindo a passagem do BBB 11. Considerando que o CNS foi considerada como um órgão imunológico privilegiado por um longo tempo, descobertas recentes sugerem um sistema muito dinâmico e fortemente regulamentado de surv imunológicoeillance do SNC. Os BMECs estão criticamente envolvidas na regulação da transmigração de células imunes. Pela expressão de selectinas sobre as suas superfícies linfócitos são induzidos selectivamente para ligar frouxamente ao endotélio. A secreção de quimiocinas que se deparam com receptores específicos na leucócitos leva à expressão ou alterações conformacionais de integrinas de leucócitos, tais como LFA-1 (antigénio de funções de linfócitos associada-1) e VLA-4 (antigénio muito tardio-4). As integrinas mediar uma adesão firme ao ligar seus counterreceptors endoteliais, por exemplo, VCAM-I (molécula de adesão celular vascular), ICAM-I (molécula de adesão intercelular) que permite a transmigração para o parênquima cerebral entre ou através BMECs do BBB 12-14. Estas e outras conclusões sublinham o papel ativo do próprio endotélio na regulação da migração de células imunes. Além disso, BMECs como parte do NVU estão envolvidos na regulação do fluxo sanguíneo cerebral linked às demandas metabólicas neuronais locais. Após estimulação astrocitário células endoteliais produzem substâncias vasoactivas, tais como o óxido nítrico, conduzindo ao relaxamento das células musculares lisas vasculares 15. Angiogênese e neurogênese no desenvolvimento, bem como na padronização paralelo adulto show de cérebro e desenvolvimento e compartilham muitas propriedades de regulação 1, 4. As células endoteliais estão criticamente envolvidas nestes processos 16, 17. Em resumo, BMECs fornecer recursos essenciais para justificar um bom desenvolvimento e funcionamento do SNC. BBB disfunção está ligada a muitas doenças neurológicas graves. No entanto, só muito poucos alvos foram identificados na interface cérebro-vascular para um tratamento específico e eficiente 18. Simplificado modelos in vitro têm sido usados ​​para compreender os mecanismos envolvidos na função e regulação de sistemas fisiológicos complexos para a lotempo ng. O isolamento como descrito por este manuscrito e estudo in vitro de murino BMECs, dada a grande variedade de rato específico nocaute estirpes, pode proporcionar uma maior compreensão da função e regulação BBB em condições fisiológicas e fisiopatológicas que se abrem novos caminhos terapêuticos.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase from &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;, Dispase from &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulant</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-derived serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Warm to room temperature before use</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Should only be used in first 2 days of culture</td></tr></tbody></table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Imediatamente após o isolamento, BMECs murino e células contaminantes formar conglomerados que flutuam no meio de cultura celular (Figura 1A, dia 0). O tratamento com pyrumycin leva a uma selecção de BMECs de murino uma vez que expressam elevados níveis de transportadores de efluxo tais como P-glicoproteína que conduz a uma resistência em relação a toxinas. Células contaminantes são muito mais suscetíveis a pyrumycin mediada citotoxicidade 19. Durante o processo de selecção pyrumicin, células contaminantes entrar morte celular apoptótica ou necrótica, enquanto MBMECs começar a prender às colagénio IV / revestidas com fibronectina placas de cultura celular (Figura 1A, dia 1 e dia 2). Até dia 5, os MBMECs proliferam a uma densidade de aprox. 80 - 90%. Eles são caracterizados pela aparência típica em forma de fuso. Na confluência, elas formam uma monocamada de células de contacto inibido não sobrepostos embaladas apertadamente, alinhados longitudinalmente e (Figura 1A, o dia 5). Porpyrumicin selecção, um elevado grau de pureza de até 99% é atingido MBMEC como demonstrado pelo marcador celular endotelial CD31 (PECAM1; Figura 1B). Os MBMECs formar monocamadas estreitamente selados interligados por proteínas de junções apertadas. Após 7-8 dias de cultura, as camadas de células endoteliais construir-se estáveis ​​para valores de resistência eléctrica (atingindo os valores típicos entre 20 - 30 Ω cm x 2). E capacitância (Figura 1C) Neste ponto de tempo de ensaios funcionais, tais como célula.dia experiências de migração 3, 20,21 e permeabilidade testes, por exemplo, com Evans azul ou dextrano, deve ser realizada. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. morfológica e propriedades funcionais de Murino BMECs. (A) Claro tempo Representante da BMECs cultivadas vistos por transmissão de luz microSCOPY mais de 5 dias. Barra de escala aplica-se para todas as imagens. (B) coloração de imunofluorescência para o marcador celular endotelial CD31 no dia 5. CD31 (verde) e DAPI (azul). (C) As células foram pré-cultivados durante 5 dias e depois transferidas para um sistema automatizado para a análise das propriedades biofísicas (resistência e capacitância). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.3K visualizações.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Vídeo: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neurociência

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Medicina

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Biologia

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolamento e Cultura de Pericitos Cerebrais Primários: Um Procedimento para Isolar e Cultivar Pericitos de Capilares Cerebrais Bovinos Sem Contaminação de Células Endoteliais

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...