Diese Arbeit wurde vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, Cells-in-Motion-Exzellenzcluster (EXC 1003 - CIM), Universität Münster (SB und SGM) und von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 SB und SGM). Wir danken Heike Blum für die hervorragenden Abbildungen.

Gemäß dem deutschen Recht des Tierschutzes und dirigierte Alle Tierversuche wurden von den lokalen Behörden (&quot;;; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz Recklinghausen, Deutschland LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW&quot;) zugelassen. 1. Allgemeine Anmerkungen für Mouse Experimente <ol><li> Führen Sie alle Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen Institutional Animal Care und Use Committee. </li><li> Halten Sie die Mäuse unter keimfreien Bedingungen und es ihnen ermöglichen, den Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum haben. </li><li> Verwenden Alter und Geschlecht abgestimmt Mäusen der experimentellen Gruppen, weil biologischen Eigenschaften können mit dem Alter und Geschlecht variieren. </li><li> Wann immer möglich versuchen, zu reduzieren, zu verfeinern oder ersetzen Tierversuche. </li></ol> 2. Herstellung des Percoll Gradient <ol><li> Mischungs 19 ml 1x PBS mit 1 ml 10-fach PBS, 1 ml FCS und 10 ml Percoll. </li><li> Führen steGiften Filtration in ein Glasrohr (Durchmesser der Filterporen: 0,2 um). Danach speichern die Lösung bei 4 ° C. </li></ol> 3. Herstellung von Endothel Zellmedium und Beschichtung von Zellkulturplatten <ol><li> Endothelzellmedium: <ol><li> Herstellung von 500 ml Medium (. Ca. 20%) 400 ml mischen DMEM-Medium (. Ca. 80%) mit 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 &amp; mgr; g / ml; ca. 0,05%), 0,5 ml Heparin (100 &amp; mgr; l / ml;. ca. 0,1%) und 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. ca. 0,1%). Pyrumycin fügen nur in den ersten 2 Tagen Kultur verwendete Zellkulturmedium. </li><li> Zuführen Sterilfiltration in ein Glasrohr (Durchmesser der Filterporen: 0,2 um). Danach speichern die Lösung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Beschichtung von Zellkulturplatten: <ol><li> 1 ml der Beschichtungslösung, eine Lösung aus 500 &amp; mgr; l ddH 2 O, 400 ul Kollagen IV (0,4 mg / ml) und 100 ul Fibronectin (0,1 mg / ml). </li><li> Decken Sie die ganze Oberfläche des EACh Vertiefung der Zellkulturplatte mit der Beschichtungslösung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung von murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (MBMEC) <ol><li> Opfern 10 erwachsenen Mäusen (8. - 12. Wochen alten C57BL / 6), durch zervikale Dislokation. Anschließend isolieren die Maus-Gehirne und Speicher in 5 ml PBS (Caveat: Arbeits steril). </li><li> Entfernen Gehirn stammt, Kleinhirne und thalami mit einer Pinzette. Trennen Hirnhäute durch vorsichtiges Aufrollen die Gehirne auf einem sterilen Löschpapier. Sammeln Sie die resultierende Hirnhäute freien Vorderhirne. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne in ein 50 ml Falcon-Röhrchen mit 13,5 ml DMEM gefüllt. </li><li> Hackfleisch das Gewebe zuerst mit einer 25 ml Pipette und dann mit einer 10 ml Pipette bis das Medium wird milchig. </li><li> Dann verdauen das Gewebe mit einer Mischung aus 0,6 ml Kollagenase CLS2 (10 mg / ml in DMEM) und 0,2 ml DNAse (1 mg / ml in PBS) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) für 1 h bei 37 ° C auf einem Orbital schüttelnr bei 180 rpm. </li><li> 10 ml DMEM zur Gewebesuspension zugegeben und zentrifugiert, die Zellen bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen (Caveat: Pellet wird leicht zu verlieren) </li><li> Um das Myelin bei 1.000 × g für 20 min bei 4 ° C entfernt, das Pellet mit einer 25 ml Pipette in 25 ml BSA-DMEM (20% w / v) (ca. 25 Mal), und zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie die obere Myelinschicht (milchig) mit einem gebrochenen Glaspasteurpipette mit größerem Durchmesser, und dann werfen Sie die BSA-Schicht mit einer normalen Pasteurpipette. </li><li> Das Pellet in 9 ml DMEM und 1 ml Kollagenase / Dispase (Endkonzentration 1 mg / ml) und 0,1 ml DNAse. Verdauen die Lösung für 1 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler bei 180 rpm (Einschränkung: verwenden Sie nicht die Pipette resuspendieren - Zellen können verloren gehen). </li><li> Während der Verdauung, zentrifugieren Sie das Percoll Lösung bei 3.000 × g für 1 h Einrichten des Dichtegradienten mit einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C, mit einer Beschleunigung, wiThout Bremse. </li><li> 10 ml DMEM zu der verdauten Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1000 g für 10 min bei 4 ° C. Dann den Überstand verwerfen und das Pellet in 2 ml DMEM. </li><li> Fügen die resuspendierten Zellen vorsichtig auf der Oberseite des Percoll-Gradienten und Zentrifuge bei 700 × g für 10 min bei 4 ° C ohne Beschleunigung und Bremse. Anmerkung: Die Zellen als Wolke in der Interphase sichtbar sind. </li><li> Nehmen ca. 12 ml der Zwischenphase mit Zellen mit einer langen sterilen Nadel und legen Sie sie in eine neue 50 ml Falcon mit 5 ml DMEM. </li><li> Zentrifugieren der Zellen erneut bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Anschließend das Pellet in endothelialen Zellmedium (Verwendung ca. 0,2 ml Medium pro 1 cm 2 Oberfläche der Zellkulturplatte). </li><li> Entfernen Beschichtungslösung aus beschichteten Zellkulturplatten (siehe Schritt 3.2) und spülen Sie jedes gut mit sterilem PBS in zwei aufeinander folgenden Waschschritte. </li><li> Pflegen Zellkulturen in EndothelzellenZellmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem sterilen Inkubator. Ändern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Split-Zellen bei 90% Konfluenz. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Blut-Hirn-Schrankenstörung ist ein Markenzeichen von verschiedenen schädlichen ZNS-Erkrankungen, zB ein Ausfall der BBB bei Multipler Sklerose ausgiebig erleichtert die CNS Invasion durch autoreaktive Immunzellen und ermöglicht die Begegnung und Zerstörung der Oligodendrozyten. Bei ischämischen Schlaganfall die Störung der BHS und die anschließende Bildung von Hirnödem sind kritische Faktoren, die sekundäre Infarktwachstum und die Gesamtüberlebenszeit der Patienten 6 zu beeinflussen. Darüber hinaus kann durch Veränderungen der BBB in abgelegenen Gebieten fokalen ischämischen Läsionen sind in der Lage, weit verbreiteten funktionellen Veränderungen des Gehirns induzieren. Allerdings sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt 5. Im Gegensatz dazu die hohe Dichte und Vielfalt der Efflux-Transporter in der funktionellen BMECs reduziert die Konzentration von nützlichen Medikamente wie Chemotherapeutika für die Hirnmalignome oder Antibiotika für Infektionskrankheiten. Daher kann ein tieferes Verständnis der Blut-Hirn-barrier Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erforderlich ist, um pharmakologische Mittel, die in der Lage, spezifisch die Sperrfunktion in der favorisierten Richtung 21 zu entwickeln. Zuverlässig in vitro-Modellen der BHS sind unverzichtbare Werkzeuge, um die Regulationsmechanismen auf BBB studieren. Viele verewigt Gehirn endothelialen Zelllinien wurden eingerichtet und als in vitro-BBB-Modelle 22 eingesetzt. Diese Zelllinien bieten gewisse Vorteile gegenüber Primär BMECs da sie schneller wachsen und bestimmte BBB Eigenschaften halten über mehrere Passagen. Jedoch kann Endothelzelllinien nicht vollständig ersetzen Primärzellen als wichtige Eigenschaften verändert werden, die mit der Übertragbarkeit der Versuchsergebnisse auf die in vivo-Situation zu vermischen. Zum Beispiel die murine Hirn Endothelzelllinie bEnd.5 drückt nur geringe diskontinuierlich verteilten tight junction-Proteine, was zu hohen Paraczellulären Permeabilität 23. BEnd.3, ein weiteres häufig verwendeten murinen Gehirn Endothelzelllinie zeigt dichte und kontinuierliche verteilt tight junctions, eine hohe transendotheliale Widerstand, mehrere Effluxtransporter und niedrige parazellulären Permeabilität. Allerdings bEnd.3 Zellschichten im Vergleich zu Primär BMECs fehlt eine echte Diskriminierung in Bezug auf die Permeation von bestimmten transzellulären und parazellulären Substraten 24. In Zubereitungen von primären Zellkulturen, können kontaminierenden Zellen signifikant mit der Gültigkeit der experimentellen Befunde stören. In dem beschriebenen Protokoll wird pyrumicin als selektives Agens verwendet für Endothelzellen hohe Reinheit zu erreichen. Trotzdem ist eine regelmäßige Kontrolle der Qualität der Zellkultur zwangsläufig erforderlich, um für eine zuverlässige Experimenten zu gewährleisten. Es gibt mehrere Verfahren für die Qualitätskontrolle, neben typischen morphologischen Eigenschaften von Endothelzellen (siehe 1A), der transendothelial Widerstand gemessen werden kann oder die Expression des endothelialen Zellmarker, wie CD31 (siehe 1B) und von Willebrand-Faktor (vWF) kann ausgewertet werden. Die Zahl der Gehirn-Endothelzellen aus einer Mausgehirn isoliert ist relativ gering und für mehrere Versuche zu diesem Zweck eine Zellkultur, haben die Gehirne von mehreren Mäusen gepoolt werden. In unserer Erfahrung, müssen mindestens 10 Mäuse für einen Versuch, die abhängig von den Ressourcen der jeweiligen Tiereinrichtung ein begrenzender Faktor sein könnte verwendet werden. Um Bias oder Störfaktoren zu vermeiden, sollte nur Mäuse mit einer identischen genetischen und ökologischen Hintergrund gebündelt. Im Gegensatz dazu Rinder- und Schweinehirn Endothelzellen Präparate bieten eine große Anzahl von Gehirnendothelzellen in einem Gehirn. Doch neben der unkomplizierten Zucht und Gehäuse, der breite und ständig wachsenden Repertoire an verfügbaren transgenen Mäusen macht primären murinen BMECs als idealeModell zur Blut-Hirn-Schrankenfunktion zu untersuchen. Mehrere wichtige Erkenntnisse über die Funktionen der BBB und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wurden aus Studien mit 2D Gewebekultursystemen kommen. Kürzlich, 3D-Kultursysteme entwickelt worden 25, wobei Endothelzellen in eine Collagenmatrix damit sie Lumen und Rohrnetze bilden gelegt. Diese neue Zellkultursysteme erlauben eine noch genauere Reproduktion des Gefäßprozessen im intakten Organismus in vivo. Die Einbindung weiterer Zellen der NVU in 3D-Zellkultursystemen, wie Perizyten und Astrozyten könnte revolutionieren die in vitro-Studium der Blut-Hirn-Schrankenfunktion; ersten Modelle wurden erst kürzlich entwickelt 26. Es gibt einige Empfehlungen für die Problembehandlung. Zunächst sterilen Arbeits ist wesentlich für die Qualität des Endothelzellenkultur. Zweitens sollte pyrumycin nur für Zelle hinzugefügt werdenin den ersten 2 Tagen Kultivierung verwendete Kulturmedium kann mehr Anwendung erhöht MBMEC Zelltod und geringer Qualität Barrierefunktion führen. Drittens sollte die in diesem Protokoll angewendet Enzyme gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet und gespeichert werden; ansonsten ihre ordnungsgemäße Funktion beeinträchtigt werden könnte. Darüber hinaus könnte die Beschichtung von Zellkulturplatten geändert, wenn Endothelzellen nicht zu befestigen. Konzentrationen von Fibronektin und Kollagen könnte verändert werden oder andere Matrixproteine ​​können zu der Beschichtungslösung zugegeben werden. Schließlich, Alter, Geschlecht, Jahreszeit des Jahres und Umweltbedingungen innerhalb der Tierhaltung sind wichtige Faktoren, die die Qualität MBMEC Isolation und Vergleichbarkeit der Versuche beeinflussen könnten. Es sollte sichergestellt werden, dass die Bedingungen vergleichbar unabhängigen Experimenten sind. Das beschriebene Protokoll sollte als Grundneuroimmunologischen Methode murine BMECs isolieren berücksichtigt werden. Die isolierten Zellen u sein könnteSED für eine Vielzahl von Anwendungen, weitere Einblicke in BBB Funktion, wie Migrationsassays, Gen- und Proteinexpressionsstudien elektro Auswertungen oder Permeabilität Experimenten zu gewinnen. Wie oben erwähnt, können 3D-Zellkultursysteme von BMECs neue Möglichkeiten, um die komplexen Mechanismen in der Regulation der BBB in Zusammenhang mit der NVU beteiligt Studie liefern. Daher wird die Isolierung von primären Endothelzellen eine unschätzbare Technik im Bereich der BBB Forschung in Zukunft so bleiben.

<html> Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) bilden Monoschichten, die ein integraler Teil der hochspezialisierten Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​sind. BMECs durch junctional Proteine ​​an einen Basalmembran befestigt verschaltet. Zusammen mit Perizyten, glatte Muskelzellen, Astrozyten Ende Füße und zirkulierenden Blutzellen bauen sie die sogenannte neurovaskulären Einheit (NVU) 1. Gegen den bisherigen Vorstellung von einer undurchlässigen Barriere zwischen Blut und zentralen Nervensystems (ZNS), die NVU ein dynamisches, hoch spezifische und geregelte Schnittstelle, die den Übergang von Fluiden, Moleküle und Zellen zwischen zerebralen Blutgefäße und des ZNS 2 steuert . Eine Dysfunktion oder Dysregulation des NVU kann initiieren und / oder dazu beitragen, eine Vielzahl von neurovaskulären, infektiöse, entzündliche oder degenerative Erkrankungen des ZNS, wie beispielsweise Schlaganfall, HIV-Enzephalopathie, multiple Sklerose, Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson 3-6. _content &quot;&gt; Die BMEC Monoschicht dicht mit einem Junction-Komplex, der aus dicht verschlossen (TJ) und Adhärenzverbindungen (AJ) 7. Der hohe elektrische Widerstand und die Niederparazelluläre Permeabilität der BBB hauptsächlich auf TJ Proteinen 8. Die TJs sind Komplexe, die durch den Transmembranproteine ​​der claudin und Occludin-Familie, die das Zytoskelett der Endothelzellen durch Adaptermoleküle gebunden sind, gebildet wie die zonulaoccludens (ZO) Proteine ​​ZO1-3 4. Adhärenzverbindungen werden hauptsächlich durch das integrale Membranprotein zusammengebaut Gefäßendothel (VE) -cadherin, das mit dem Zytoskelett via catenins 8 verbunden ist. Die dichte Abdichtung des BBB verhindert den freien Austausch von Substraten und Zellen zwischen Blut und Liquor. Ausnahmen von dieser Regel sind lipophile, kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht &lt;400 Da, die Lage, die BBB von Lipid-vermittelte Diffusion 9 überqueren sind. Der Durchgang der größeren und / oderhydrophile Moleküle, wie Glucose, Aminosäuren, Peptide, Proteine ​​und viele Arzneimittel ist für stark gesteuerte transzellulären Transportsysteme 10, die in fünf Hauptkategorien eingeteilt werden können beschränkt: trägervermittelten Transport, Ionentransport, aktive Ausflusstransport, Rezeptor-vermittelte Transport und Caveolae-vermittelten Transport 4. Diese Transportsysteme unterstützen die Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS, die für eine genaue Signalerzeugung, Transduktion und Integration notwendig ist. Außerdem sind BMECs Lage, den Übergang von unterschiedlichen Molekülen aktiv zu steuern, indem die Expression einer Vielzahl von Ectoenzyme. Diese Enzyme sind an der Zelloberfläche lokalisiert und ändern spezifischen endogenen und exogenen Substraten zu behindern oder Zulassen des Übergangs des BBB 11. Während das ZNS wurde als Immunprivilegierten Organ für eine langfris Zeit betrachtet, deuten neuere Erkenntnisse eine eher dynamische und dicht geregelten System der Immun surveillance des ZNS. Die BMECs kritisch bei der Regulation der Immunzelltransmigration beteiligt. Durch die Expression der Selektine auf ihrer Oberfläche Lymphozyten selektiv veranlaßt, locker an das Endothel zu befestigen. Die Sekretion von Chemokinen, die mit spezifischen Rezeptoren auf Leukozyten stoßen führt zu der Expression oder Konformationsänderungen von Leukozyten-Integrine, wie LFA-1 (Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen-1) und VLA-4 (sehr späte Antigen-4). Die Integrine vermitteln eine feste Adhäsion durch Bindung ihrer endothelialen Gegenrezeptoren, zB VCAM-I (vascular cell adhesion molecule), ICAM-I (interzelluläres Adhäsionsmolekül) ermöglicht die Transmigration in das Hirnparenchym zwischen oder über BMECs des BBB 12-14. Diese und andere Befunde unterstreichen die aktive Rolle des Endothels selbst bei der Regulierung der Immunzellmigration. Weiterhin BMECs als Teil der NVU sind an der Regulation der Hirndurchblutung li beteiligtum lokale neuronale metabolischen Anforderungen nked. Auf Astrozyten Stimulations Endothelzellen vasoaktiven Substanzen wie Stickstoffmonoxid führt zur Entspannung der glatten Gefäßmuskelzellen 15. Angiogenese und Neurogenese in den Entwicklungs sowie im erwachsenen Gehirn Show parallel Strukturierung und Entwicklung und teilen viele Eigenschaften der Verordnung 1, 4. Endothelzellen werden kritisch in diesen Prozessen 16, 17 beteiligt. Zusammenfassend BMECs liefern wichtige Funktionen, um eine richtige Entwicklung und das Funktionieren des ZNS zu rechtfertigen. BBB Dysfunktion ist vielen schweren neurologischen Störungen verbunden. Jedoch haben nur wenige Ziele auf der Gehirngefäß Schnittstelle für eine spezifische und effiziente Behandlung 18 identifiziert. In vitro Modellen vereinfacht wurden verwendet, um die Mechanismen in der Funktion und Regulation von komplexen physiologischen Systeme für eine lo beteiligt verstehenng Zeit. Die Isolierung der durch diese Handschrift und der in-vitro-Studie von murinen BMECs beschrieben, angesichts der Vielzahl von spezifischen Maus-Knockout-Stämme, könnte ein weiteres Verständnis der BBB Funktion und Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eröffnen neue therapeutische Wege zu schaffen.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase from &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;, Dispase from &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulant</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-derived serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Warm to room temperature before use</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Should only be used in first 2 days of culture</td></tr></tbody></table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Unmittelbar nach der Isolierung, murine BMECs und kontaminierenden Zellen zu bilden Konglomerate schwebend in dem Zellkulturmedium (1A, Tag 0). Die Behandlung mit pyrumycin führt zu einer Auswahl von Maus BMECs da sie hohe Effluxtransporter wie P-Glykoprotein, was zu einer relativen Resistenz gegen Toxine exprimieren. Kontaminierenden Zellen sind viel anfälliger für Zytotoxizität 19 pyrumycin. Während des Prozesses der pyrumicin Auswahl kontaminierenden Zellen geben apoptotischen oder nekrotischen Zelltod, während MBMECs beginnen, um das Kollagen IV / Fibronektin beschichtete Zellkulturplatten (1A, Tag 1 und Tag 2) zu befestigen. Bis Tag 5 werden die MBMECs vermehren zu einer Dichte von ca.. 80 bis 90%. Sie werden durch die typische spindelförmiges Aussehen aufweist. Bei Konfluenz werden, bilden sie eine Monoschicht aus dicht gepackten, in Längsrichtung ausgerichteten und nicht-überlappenden Kontakt inhibierten Zellen (1A, Tag 5). Durchpyrumicin Auswahl, eine hohe Reinheit von bis zu 99% MBMEC erreicht wird, wie durch die endotheliale Zellmarker CD31 nachgewiesen (PECAM1; 1B). Die MBMECs bilden dicht versiegelten Monoschichten von Tight Junction-Proteinen verbunden. Nach 7-8 Tagen Kultur bauen die endothelialen Zellschichten bis stabile Werte für den elektrischen Widerstand (Erreichen typische Werte zwischen 20 - 30 Ω x cm 2). Und Kapazität (1C) Zu diesem Zeitpunkt, funktionelle Assays wie zell- Migrationsversuche 3, 20,21 und Durchlässigkeitstests, zB mit Evans Blau oder Dextran, durchgeführt werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Murine BMECs. (A) Repräsentative Zeitverlauf der kultivierten BMECs durch Übertragungslichtmikro angesehenskopie über 5 Tage. Maßstab gilt für alle Bilder. (B) Immunfluoreszenzfärbung für die endotheliale Zellmarker CD31 an Tag 5. CD31 (grün) und DAPI (blau). (C) Zellen wurden für 5 Tage vorkultiviert und dann in einem automatisierten System für die übertragene Analyse der biophysikalischen Eigenschaften (Widerstand und Kapazität). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.2K Aufrufe.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Serie: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Medizin

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Biologie

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolierung und Kultivierung von primären Hirnperizyten: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...