وأيد هذا العمل من قبل مركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 03/12، SB)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، خلايا الحركة في والعنقودية التميز (EXC 1003 - CIM)، جامعة مونستر (SB لوSGM) وقبل عدا كرونة-فريزنيوس شتيفتونغ (2012_A88 لSB وSGM). نشكر هايكه بلوم للرسوم توضيحية ممتازة.

وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل السلطات المحلية (&quot;LandesamtfürNatur، UMWELT اوند Verbraucherschutz NRW، Fachbereich 87، Tiergesundheit، Tierschutz، ركلينغاوسين، ألمانيا&quot;) والتي أجريت وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان. 1. تعليقات عامة عن تجارب ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام كل منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفئران السن والجنس المطابقة في المجموعات التجريبية وذلك لأن الخصائص البيولوجية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما أمكن ذلك في محاولة للحد من، أو استبدال صقل التجارب على الحيوانات. </li></ol> 2. إعداد التدرج Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 19 مل من 1X PBS مع 1 مل 10X PBS، 1 مل و 10 مل FCS Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الظريفتثير غضب الترشيح في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. إعداد متوسطة البطانة Endothelium خلية وطلاء الثقافة الخلية لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البطانية المتوسطة الخلية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل المتوسطة: (حوالي 20٪) مزيج 400 مل DMEM المتوسطة (حوالي 80٪) مع 100 مل PDS، 0.25 مل bFgF (20 ميكروغرام / مل، حوالي 0.05٪)، و 0.5 مل الهيبارين (100 ميكرولتر / مل؛ حوالي 0.1٪) و 0.5 مل pyrumycin (4 ملغ / مل؛ حوالي 0.1٪). إضافة pyrumycin فقط لمستنبت الخلايا المستخدمة في الأيام الأولى 2 من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الترشيح العقيمة في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من لوحات زراعة الخلايا: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل1 مل من محلول طلاء، وإعداد محلول من 500 ميكرولتر DDH 2 O، 400 ميكرولتر الكولاجين الرابع (0.4 ملغ / مل) و 100 ميكرولتر فبرونيكتين (0.1 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي السطح كله من EACح بئر من لوحة زراعة الخلايا مع الحل الطلاء. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol></li></ol> 4. عزل الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران (MBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 تضحية الفئران البالغة 8 (- 12 أسبوعا من العمر، C57BL / 6) من قبل خلع عنق الرحم. بعد ذلك عزل الماوس العقول وتخزينها في 5 مل من برنامج تلفزيوني (التحذير: العمل العقيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ينبع الدماغ، مخيخات والمهاد مع ملقط. فصل السحايا قبل المتداول بعناية العقول على ورقة النشاف العقيمة. جمع المجانية السحايا الناتجة forebrains. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أدمغة إلى أنبوب 50 مل الصقر مليئة 13.5 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخطر على الأنسجة، أولا مع ماصة 25 مل، ثم مع ماصة 10 مل حتى يصبح حليبي وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم هضم الأنسجة مع مزيج من 0.6 مل كولاجيناز CLS2 (10 ملغ / مل في DMEM) و 0.2 مل الدناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على المدار هزةفي ص 180 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من DMEM أضافت إلى تعليق الأنسجة والخلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف نبذ (التحذير: بيليه من السهل أن تفقد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة النخاعين، resuspend الكرية مع ماصة 25 مل في 25 مل من BSA-DMEM (20٪ ث / ت) (حوالي 25 مرة)، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طبقة المايلين العليا (حليبي) مع كسر الزجاج ماصة باستور مع قطر أكبر، ومن ثم التخلص من طبقة BSA مع ماصة باستير العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 9 مل DMEM وإضافة 1 مل كولاجيناز / dispase (تركيز النهائي هو 1 ملغ / مل) و 0.1 مل الدناز. هضم الحل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة (تحذير: لا تستخدم ماصة ل resuspend - خلايا يمكن أن تضيع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال عملية الهضم، جهاز طرد مركزي الحل Percoll لإعداد التدرج الكثافة باستخدام نابذة فائقة السرعة في 3000 x ج لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع التسارع، وايتوت الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من DMEM إلى تعليق خلية هضمها. الطرد المركزي في 1000 x ج لتعليق لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ثم تجاهل طاف و resuspend بيليه في 2 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الخلايا معلق بعناية على قمة التدرج Percoll والطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية دون التسارع والفرامل. ملاحظة: الخلايا مرئية مثل سحابة في الطور البيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ تقريبا. 12 مل من الطور البيني مع الخلايا بإبرة معقمة طويلة ووضعها في جديد 50 مل الصقر مع 5 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد ذلك resuspend الكرية في البطانية المتوسطة الخلية (استخدام حوالي 0.2 مل من المتوسط ​​في 1 سم 2 من سطح لوحة زراعة الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطلاء من حل المغلفة لوحات زراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.2)، وشطف جيدا مع كل برنامج تلفزيوني العقيمة في خطوتين غسل متتالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مزارع الخلايا البطانية فيمتوسطة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة معقمة. تغيير المتوسطة كل يومين أو ثلاثة أيام. انقسام الخلايا في 90٪ التقاء. </li></ol>

<ol>
	<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology.">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li><li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain;+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development.">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+(TREK1)+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS.">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li><li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging.">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li><li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li><li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-to-cell+junctions:+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis.">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+delivery.">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li><li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions.">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier.">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system.">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li><li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crawl,+cross:+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers.">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li><li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation.">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+NKG2D++T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation.">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455 (2013).</li><li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone.">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3,+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4.">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li><li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events.">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li><li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier.">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ضعف الدم في الدماغ من العوائق هو السمة المميزة لمختلف أمراض الجهاز العصبي المركزي الضارة، مثل انهيار من BBB في التصلب المتعدد يسهل على نطاق واسع للغزو من قبل الجهاز العصبي المركزي الخلايا المناعية autoreactive وتمكن من لقاء وتدمير الخلايا قليلة التغصن. في السكتة الدماغية اختلال BBB وتشكيل لاحق من الوذمة الدماغية من العوامل الهامة التي تؤثر على نمو احتشاء الثانوي وبقاء الكلي للمرضى 6. وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات من BBB في المناطق النائية الآفات الدماغية اتصال قادرة على إحداث تغييرات وظيفية واسعة النطاق من الدماغ. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة إلى حد كبير 5. في المقابل، فإن كثافة عالية وتنوع النقل هروب رأس المال في BMECs ظيفية يقلل من تركيز الأدوية النافعة مثل مبحث المعالجة الكيميائية عن الأورام الخبيثة في المخ أو المضادات الحيوية للأمراض المعدية. لذا، فهم أعمق للدماغ بار الدممطلوب رير وظيفة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض لتطوير كلاء الدوائية التي تكون قادرة على تنظيم تحديدا وظيفة الحاجز في الاتجاه المفضل 21. يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج من BBB هي أدوات لا غنى عنها لدراسة الآليات التنظيمية على BBB. وقد تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا البطانية خلد الدماغ ويعمل كما هو الحال في المختبر نماذج BBB 22. هذه خطوط الخلايا توفر مزايا معينة على BMECs الابتدائية لأنها تنمو أسرع والحفاظ على الخصائص BBB معينة على مدى عدة فقرات. ومع ذلك، يمكن للخطوط الخلايا البطانية ليس بديلا كاملا للخلايا الأولية يتم تغيير الخصائص الهامة كما أن تختلط مع إمكانية نقل نتائج التجارب إلى الوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، خط الخلية البطانية دماغ الفئران bEnd.5 عن مستويات منخفضة فقط من البروتينات وزعت متقطع مفرق ضيقة مما يؤدي إلى ارتفاع paracنفاذية ellular 23. BEnd.3، الفئران البطانية الدماغ خط خلية أخرى تستخدم في كثير من الأحيان، يدل على التقاطعات كثيفة ومستمرة بتوزيع ضيقة، ومقاومة transendothelial عالية، عدة ناقلات هروب رأس المال وانخفاض نفاذية paracellular. ومع ذلك، طبقات الخلايا bEND.3 مقارنة BMECs الابتدائية تفتقر إلى التمييز الحقيقي فيما يتعلق تخلل العابر للبعض وركائز paracellular 24. في الأعمال التحضيرية للثقافات الخلية الأولية، يمكن خلايا تلويث تتدخل بشكل كبير مع صحة النتائج التجريبية. في البروتوكول وصفها، يستخدم pyrumicin كعامل انتقائي للخلايا البطانية لتحقيق نقاوة عالية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مراقبة الجودة العادية للثقافة الخلية حتما إلى ضمان للتجارب موثوقة. هناك عدة طرق لمراقبة الجودة، إلى جانب الخصائص المورفولوجية نموذجي من الخلايا البطانية (انظر الشكل 1A)، وtransendotheliaيمكن قياس لتر المقاومة أو قد يتم تقييم التعبير عن البطانية علامة الخلية مثل CD31 (انظر الشكل 1B) أو عامل فون ويلبراند (VWF). عدد الخلايا البطانية الدماغ معزولة عن بعضها مخ الفأر منخفض نسبيا وإنشاء ثقافة الخلية المناسبة لتجارب متعددة، العقل المدبر للعديد من الفئران يجب أن تكون مجمعة. في تجربتنا، وتحتاج على الأقل 10 الفئران لاستخدامها في تجربة واحدة التي قد تكون عاملا مقيدا اعتمادا على موارد مرفق الحيوانية منها. من أجل تجنب التحيز أو عوامل خارجية، ينبغي تجميع الفئران فقط مع خلفية وراثية وبيئية مماثلة. في المقابل، البقر والخنزير التحضيرات الخلايا البطانية الدماغ توفير عدد كبير من الخلايا البطانية الدماغ المتاحة في الدماغ واحد. ولكن، إلى جانب تربية غير معقدة، والإسكان، وذخيرة واسعة ومتزايدة من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة يجعل الفئران الأساسي BMECs باعتباره المثل الأعلىنموذج لدراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وتأتي العديد من النتائج الرئيسية التي تتعلق بوظائف BBB والآليات الجزيئية الكامنة من الدراسات في أنظمة زراعة الأنسجة 2D. مؤخرا، تم تطوير نظم الاستزراع 3D 25، حيث توضع الخلايا البطانية داخل مصفوفة الكولاجين وتمكينهم من تشكيل التجويف والشبكات الأنبوبية. هذه الأنظمة الثقافة خلية جديدة تسمح لاستنساخ أكثر دقة من العمليات الدموية في الكائن الحي سليمة في الجسم الحي. إشراك المزيد من خلايا NVU في 3D أنظمة زراعة الخلايا، مثل الخلايا النجمية وpericytes قد تحدث ثورة في المختبر دراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وقد تم مؤخرا تطوير النماذج الأولى 26. هناك بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا وقبل كل عمل عقيم أمر ضروري لنوعية زراعة الخلايا البطانية. ثانيا، ينبغي أن يضاف pyrumycin فقط للخليةمستنبت المستخدمة في الأيام الأولى 2 للثقافة، قد يؤدي إلى زيادة الطلب أطول MBMEC موت الخلايا وانخفاض وظيفة الحاجز الجودة. ثالثا، الانزيمات المطبقة في هذا البروتوكول يجب أن تستخدم وتخزن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلاف ذلك قد يثير الشبهة وظيفتها المناسبة. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طلاء لوحات ثقافة الخلية إذا الخلايا البطانية لا نعلق. قد تتغير تركيزات فبرونيكتين والكولاجين أو قد تضاف البروتينات مصفوفة أخرى إلى حل الطلاء. أخيرا، العمر، الجنس، الموسم الشروط العام والبيئية داخل المنشأة الحيوانية من العوامل الهامة التي قد تؤثر على نوعية MBMEC العزلة والمقارنة بين التجارب. يجب التأكد من أن الظروف قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة. ينبغي النظر في بروتوكول صفها بأنها طريقة neuroimmunological الأساسي لعزل BMECs الفئران. الخلايا المعزولة قد يكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لمجموعة واسعة من التطبيقات للحصول على مزيد من التبصر في وظيفة BBB، مثل فحوصات الهجرة والجينات ودراسات التعبير البروتين، والتقييمات الكهربية أو تجارب النفاذية. كما ذكر أعلاه، نظم زراعة الخلايا 3D من BMECs قد توفر فرصا جديدة لدراسة الآليات المعقدة التي تنطوي عليها تنظيم BBB في سياق NVU. وبالتالي، فإن عزل الخلايا البطانية الأولية تبقى تقنية لا تقدر بثمن في مجال البحث BBB في المستقبل.

<html> الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الخلايا البطانية (BMEC) شكل الطبقات الوحيدة التي تشكل جزءا لا يتجزأ من درجة عالية من التخصص الدم في الدماغ من العوائق (BBB). مترابطة BMECs من البروتينات صلي تعلق على الغشاء القاعدي. جنبا إلى جنب مع pericytes، وخلايا العضلات الملساء، قدم نهاية نجمي وخلايا الدم يبنون ما يسمى وحدة وعائية عصبية (NVU) 1. ضد فكرة سابقة من حاجز كتيم بين الدم و-عصبي-النظام المركزي (CNS)، وNVU هو واجهة ديناميكية ومحددة للغاية والتنظيم الذي يسيطر على الانتقال من السوائل، والجزيئات والخلايا بين الأوعية الدموية الدماغية والجهاز العصبي المركزي 2 . خلل وظيفي أو التقلبات في NVU قد بدء و / أو المساهمة في مجموعة متنوعة من الوعائية العصبية، والأمراض المعدية، والتهابات أو التنكسية في الجهاز العصبي المركزي، مثل السكتة الدماغية، ومرض الاعتلال الدماغي، والتصلب المتعدد، الزهايمر أو مرض باركنسون 3-6. _content &quot;&gt; وختم أحادي الطبقة BMEC بإحكام من قبل مجمع صلي تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ) 7. والمقاومة الكهربائية عالية ونفاذية منخفضة paracellular من BBB تقوم أساسا على البروتينات TJ (8). وTJS و المجمعات التي شكلتها البروتينات عبر الغشاء من عائلة claudin وoccludin، التي ترتبط الهيكل الخلوي للخلايا البطانية من قبل جزيئات محول، مثل zonulaoccludens (ZO) البروتينات ZO1-3 4، ويتم تجميعها بشكل رئيسي تقاطعات الملتصقة بها بروتين الغشاء لا يتجزأ الوعائية البطانية (VE) -cadherin، الذي يرتبط الهيكل الخلوي عبر catenins 8. وختم ضيق من BBB يمنع التبادل الحر للركائز والخلايا بين الدم والسائل النخاعي. استثناءات لهذه القاعدة هي محبة للدهون، جزيئات صغيرة ذات وزن جزيئي &lt;400 دا، والتي هي قادرة على عبور BBB من قبل بوساطة الدهون نشر 9. مرور أكبر و / أوجزيئات ماء، مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية، والببتيدات والبروتينات والعديد من الأدوية يقتصر على أنظمة رقابة شديدة النقل العابر لل10، والتي يمكن تصنيفها إلى خمس فئات رئيسية هي: النقل بوساطة الناقل، نقل أيون، والنقل هروب رأس المال النشط، بوساطة مستقبلات النقل، وcaveolae بوساطة النقل 4. هذه الأنظمة تساعد على نقل الحفاظ على التوازن للجهاز العصبي المركزي، وهو مطلوب لجيل إشارة دقيقة، التنبيغ والتكامل. وعلاوة على ذلك، BMECs هي قادرة على السيطرة بفاعلية على انتقال الجزيئات متميزة من خلال التعبير عن مجموعة متنوعة من ectoenzymes. يتم ترجمة هذه الإنزيمات على سطح الخلية وتعديل ركائز الداخلية والخارجية التي تعيق أو محددة تسمح بالانتقال من BBB 11. في حين اعتبر الجهاز العصبي المركزي كجهاز المناعة حظا لفترة طويلة، وتشير النتائج الأخيرة لنظام ديناميكي ومنظم بإحكام بدلا من surv المناعةeillance من الجهاز العصبي المركزي. وBMECs تشارك بشكل حاسم في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. من خلال التعبير عن selectins على الخلايا الليمفاوية سطحها والناجم بشكل انتقائي إرفاق فضفاضة إلى البطانة. إفراز كيموكينات التي تواجهها مع مستقبلات معينة على الكريات البيض يؤدي إلى التعبير أو تغيير متعلق بتكوين integrins من الكريات البيض، مثل LFA-1 (وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد 1) وVLA-4 (أواخر جدا مستضد 4). وintegrins توسط في التصاق متين من قبل ملزم counterreceptors البطانية، وعلى سبيل المثال VCAM-I (الأوعية الدموية جزيء التصاق الخلية)، ICAM-I (بين الخلايا جزيء التصاق) تمكين التهجير في لحمة بين الدماغ أو من خلال BMECs من BBB 12-14. هذه النتائج وغيرها تؤكد على الدور النشط للالبطانة نفسها في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، BMECs كما يشارك جزءا من NVU في تنظيم تدفق الدم الدماغي لىnked لمطالب الأيضية العصبية المحلية. على التحفيز نجمي الخلايا تنتج الخلايا البطانية المواد فعال في الأوعية مثل أكسيد النيتريك مما يؤدي إلى التخفيف من خلايا العضلات الملساء الوعائية 15. الأوعية الدموية والخلايا العصبية في البلدان النامية وكذلك في المعرض الدماغ الكبار الزخرفة موازية والتنمية وتبادل العديد من خصائص التنظيم 1، 4. الخلايا البطانية وتشارك بشكل حاسم في هذه العمليات 16، 17. باختصار، BMECs توفر ميزات أساسية لتبرير التنمية السليمة وأداء الجهاز العصبي المركزي. يرتبط ضعف BBB إلى العديد من الاضطرابات العصبية الحادة. ومع ذلك، فقد تم التعرف سوى عدد قليل جدا من الأهداف في واجهة الدماغ الأوعية الدموية لعلاج محدد وفعال 18. نماذج مبسطة في المختبر استخدمت لفهم الآليات التي تشارك في تنظيم وظيفة من الأنظمة الفسيولوجية المعقدة للوالوقت نانوغرام. العزلة كما وصفها هذا المخطوط والدراسة في المختبر من الفئران BMECs، نظرا لمجموعة واسعة من الماوس خروج المغلوب-سلالات محددة، قد يوفر المزيد من التفهم لوظيفة BBB والتنظيم في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض فتح آفاقا علاجية جديدة.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase from &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;, Dispase from &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulant</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-derived serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Warm to room temperature before use</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Should only be used in first 2 days of culture</td></tr></tbody></table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

مباشرة بعد العزلة، BMECs الفئران وخلايا تلويث تشكيل تكتلات عائمة في مستنبت الخلية (الشكل 1A، يوم 0). العلاج مع pyrumycin يؤدي إلى مجموعة مختارة من BMECs الفئران لأنها تعبير عن مستويات عالية من الناقلين هروب رأس المال مثل P-بروتين سكري مما يؤدي إلى مقاومة نسبية للسموم. خلايا تلويث أكثر عرضة بكثير للpyrumycin السمية الخلوية بوساطة 19. خلال عملية الاختيار pyrumicin، خلايا تلويث تدخل موت الخلايا أفكارك أو الناخر، في حين تبدأ MBMECs لنعلق على الكولاجين IV / فبرونيكتين المغلفة لوحات زراعة الخلايا (الشكل 1A، يوم 1 ويوم 2). حتى يوم 5، وMBMECs تتكاثر لكثافة تقريبا. 80-90٪. فهي تتميز نموذجي ظهور على شكل مغزل. في التقاء، وتشكيل أحادي الطبقة من الخلايا تحول دون الاتصال غير متداخلة معبأة بإحكام، تتماشى طوليا و(الشكل 1A، يوم 5). بواسطةيتم التوصل pyrumicin الاختيار، نقاء عالية تصل إلى 99٪ MBMEC كما يتبين من علامة الخلية البطانية CD31 (PECAM1، الشكل 1B). وMBMECs تشكيل الطبقات الوحيدة مغلقة بإحكام مترابطة من البروتينات مفرق ضيقة. بعد 7 - 8 أيام للثقافة، طبقات الخلايا البطانية تبنى القيم المستقرة للمقاومة الكهربائية (الوصول إلى القيم النموذجية بين 20 - 30 Ω س سم 2). والسعة (الشكل 1C) عند هذه النقطة مرة المقايسات الفنية مثل الخلوي تجارب الهجرة 3، 20،21 ونفاذية الاختبارات، على سبيل المثال مع ايفانز الأزرق أو ديكستران، يجب أن يتم تنفيذ. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. خصائص المورفولوجية والوظيفية من الفئران BMECs. (A) بالطبع الوقت تمثيلي من BMECs مثقف ينظر إليها من قبل انتقال الضوء الصغيرscopy أكثر من 5 أيام. ينطبق شريط النطاق لجميع الصور. (B) تلطيخ المناعي للخلايا البطانية علامة CD31 CD31 في اليوم 5. (الخضراء) ودابي (الأزرق). وقد precultured (C) خلايا لمدة 5 أيام، ثم نقل إلى نظام آلي ل تحليل الخصائص الفيزيائية الحيوية (المقاومة والسعة). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.2K Views.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Developmental Biology

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Medicine

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

عزل الخلايا البطانية لرئة الفأر الأولية

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Biology

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

العزل والتحليل الوظيفي للبطانة الشريانية لحمة دماغ الفأر

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

عزل واستزراع خلايا التمويح الأولية في الدماغ: إجراء لعزل واستزراع الخلايا المحيطة من الشعيرات الدموية في دماغ الأبقار دون تلوث الخلايا البطانية

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...