We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da KU Leuven e estavam em estrita conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e com a legislação belga (KB de 29 de Maio de 2013). Cada possível esforço foi feito para minimizar o sofrimento dos animais e para reduzir o número de animais. 1 Tratamento e Anestésicos Animais <ol><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (75 mg / ml) e cloridrato de medetomidina (1 mg / kg) em solução salina. </li><li> Confira os reflexos, beliscar os dedos dos pés com uma pinça para garantir o mouse é completamente sedado. </li><li> Aplicar álcool 70% para desinfecção das pálpebras e da região em torno do olho usando uma ponta de algodão. Confira o reflexo da pálpebra para avaliar adicionalmente o grau de sedação. </li></ol> 2 Retirar o Eye <ol><li> Certifique-se de que o animal reside em um plano, seco esuperfície lisa. </li><li> Esterilizar uma pinça com uma curva, ponta serrilhada (tamanho da ponta preferido: 0,5 x 0,4 mm). </li><li> Pressione suavemente para o canto (canto do olho) com a pinça até que o globo ocular é deslocado do soquete e do nervo óptico é alcançável. </li><li> Guia da pinça por trás do olho. Pressione e segure o nervo óptico firmemente, de preferência com o início da curva e não na ponta da pinça. Isso vai ajudar a levantar o globo da tomada e apertar o nervo óptico completo. </li><li> Faça movimentos circulares com a mão que segurava a pinça na direção com o mínimo de resistência, enquanto o mouse permanece sobre a superfície plana. O rato vai oscilar ao longo da superfície de acordo com a direcção do movimento da mão. </li><li> Executar esta ação com um aumento gradual de velocidade até o nervo óptico é restrito em dois (geralmente entre 7 a 15 movimentos circulares, aproximadamente meia a uma volta completa por segundo). Por isso, o globo ocular é destacadaremovido. </li></ol> Cuidado 3 Pós-operatório <ol><li> Em caso de sangramento (raro), preencher a órbita com um coagular viscoso e agente hemostático. </li><li> Inverta a anestesia por injeção de 1 mg / kg de cloridrato de atipamezol em soro fisiológico por via intraperitoneal. </li><li> Administrar 1 mg / kg de meloxicam por via intraperitoneal a cada 24 horas, para aliviar a dor. </li><li> Aplicar pomada para o olho restante para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Deixar o animal recuperar em uma placa de aquecimento ou envolva o animal em material isolante em uma gaiola separado para controlar a temperatura do corpo. </li><li> Medir o peso do rato a cada dia durante pelo menos 2 dias. A perda de peso pode indicar sofrimento e, neste caso, continuar o tratamento com meloxicam, até que o animal é completamente recuperado. </li></ol>

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	<li>Toldi, J., Feh&#233;r, O., Wolff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+induced+by+neonatal+monocular+(and+binocular)+enucleation.">Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation.</a> Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).</li><li>Steeves, J. K. E., Gonz&#225;lez, E. G., Steinbach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+with+one+eye:+a+review+of+visual+function+following+unilateral+enucleation.">Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation.</a> Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).</li><li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cross-modal+plasticity+in+adult+mouse+visual+cortex+following+monocular+enucleation.">Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation.</a> Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).</li><li>Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cross-modal+aspect+of+mouse+visual+cortex+plasticity+induced+by+monocular+enucleation+is+age-dependent.">The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent.</a> Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping.">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).</li><li>Morales, B., Choi, S. -. Y., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+rearing+alters+the+development+of+GABAergic+transmission+in+visual+cortex.">Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).</li><li>Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binocular+input+coincidence+mediates+critical+period+plasticity+in+the+mouse+primary+visual+cortex.">Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).</li><li>Konur, S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+and+filopodial+motility+in+primary+visual+cortex:+Reduced+effects+of+activity+and+sensory+deprivation.">Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation.</a> Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+A+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li><li>Galindo-Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+adult+mice:+Quantitative+and+topographic+time+course+analyses.">Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses.</a> Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).</li><li>Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+ocular+dominance+plasticity+and+NMDA+receptor+subunit+expression+in+glutamic+acid+decarboxylase-65+knock-out+mice.">Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice.</a> The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).</li><li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+functional+subdivisions+in+the+visual+cortex+of+the+adult+mouse.">Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).</li><li>Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+expression+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+tyrosine+kinase+B+mRNAs+and+distribution+and+ultrastructural+localization+of+their+proteins+in+the+visual+pathway+of+the+adult+rat.">Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat.</a> Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).</li><li>Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+the+structural+remodeling+of+the+visual+system+after+ocular+enucleation.">Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation.</a> Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).</li><li>Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -. T., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cell+proliferation+upon+enucleation+in+direct+retinal+brain+targets+in+the+visual+system+of+the+adult+mouse.">Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).</li><li>Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+binocular+competition+in+the+visual+cortex+begins+at+eye+opening.">Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening.</a> Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).</li><li>Toldi, J., Farkas, T., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+enucleation+induces+cross-modal+changes+in+the+barrel+cortex+of+rat.+A+behavioural+and+electrophysiological+study.">Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study.</a> Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).</li><li>Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-modal+plasticity+after+monocular+enucleation+of+the+adult+rabbit.">Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit.</a> Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).</li><li>Lalonde, J., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+CREB+phosphorylation+and+neuroadaptive+gene+expression+in+area+V1+of+adult+monkeys+after+monocular+enucleation.">Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).</li><li>You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+degeneration+along+the+visual+pathway+after+optic+nerve+injury.">Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury.</a> PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).</li><li>Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+anterior+visual+system+development+following+early+monocular+enucleation.">Altered anterior visual system development following early monocular enucleation.</a> NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).</li><li>Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+visual+cortex+of+neonatal+monocular+enucleated+rat:+a+proton+magnetic+resonance+spectroscopy+study.">Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).</li><li>Dyer, R. S., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+enucleation+in+retinal+degenerate+mice.">Effects of enucleation in retinal degenerate mice.</a> Physiology &amp; behavior. 14 (2), 207-210 (1975).</li><li>Smith, S. A., Bedi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+eye+enucleation+in+adult+rats+causes+neuronal+loss+in+the+contralateral+superior+colliculus.">Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus.</a> Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+monocular+enucleation+on+calbindin-D+28k+and+c-Fos+expression+in+the+lateral+geniculate+nucleus+in+rats.">Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats.</a> Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).</li><li>Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+eye+cortical+maps+are+uniquely+sensitive+to+binocular+plasticity.">Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity.</a> Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).</li><li>Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+protein+and+neuronal+activity+markers+define+regional+architectonic+parcellation+in+the+mouse+visual+cortex.">Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).</li><li>Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+in+primate+visual+cortex+assessed+by+immunostaining+for+the+transcription+factor+Zif268.">Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268.</a> Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para realizar a enucleação de sucesso de acordo com o nosso método, os passos mais críticos a serem considerados são: 1) usando uma pinça com ponta curva e serrilhada de tamanho adequado; 2) realizar a enucleação em uma superfície lisa e seca; e 3) aumentando gradualmente a velocidade até os movimentos circulares no sentido com o mínimo de atrito. Para um resultado eficaz, é imprescindível a utilização de uma pinça adequada, caracterizada por uma ponta curvada e dentada (tamanho do bico preferido: mouse: 0,5 x 0,4 mm; rato: 2,15 x 1,3 mm). A curvatura permite um fácil acesso ao nervo óptico após o deslocamento do globo ocular e é necessário para a colocação correta das mãos ao executar os movimentos circulares. Dicas lisos não são recomendadas, uma vez que não têm a aderência necessária ao segurar o nervo óptico. A falha em realizar o nervo óptico adequadamente durante os movimentos circulares resulta na ruptura da artéria oftálmica, pobre descolamento do olho e, por conseguinte, uma fraca reprodutibilidade.Por isso recomenda-se a primeira prática desta técnica em animais sacrificados para a otimização da pinça de manipulação para garantir bem-estar animal máximo uma vez a aplicação do método in vivo. Enucleação ocular sucesso tem sido, recentemente, também realizado no rato no nosso laboratório utilizando a mesma técnica, excepto para virar o corpo do animal e manter manualmente a pinça estacionário. Uma limitação da técnica é que ela poderia danificar a retina. Portanto, este método é menos adequado para a recolha de retinas de realizar histologia 5. Além disso, o nosso método é limitada para deixar a abertura do olho idades desde o olho tem de ser deslocado a partir da tomada, sem remoção ou corte das pálpebras. Enucleação dos olhos de diferentes espécies, incluindo roedores, é rotineiramente realizado utilizando métodos alternativos, que frequentemente implicam a remoção das pálpebras e o corte do nervo óptico 18,23-25. Estes metods tendem a ser mais invasivos e têm uma curva de aprendizagem mais elevada do que a técnica aqui descrita. Sem a necessidade de remover ou suturando as pálpebras, o tempo de recuperação pós-operatório é minimizado, resultando em maior bem-estar dos animais e os resultados mais reprodutíveis.

Remoção de um olho e, assim, de forma irreversível destruindo a superfície receptor sensorial (retina), impõe uma perda considerável de informações sensoriais ao longo da via visual. O modelo de enucleação no sistema visual juvenil e adulta tem provado ser valiosos para compreender o desenvolvimento, plasticidade e função de diferentes centros visuais 1-4. As conseqüências moleculares, celulares e fisiológicos desta privação sensorial pode fornecer insights sobre como o desenvolvimento normal é regulada e como estabelecido circuitos corticais enfrentar e mudar sua estrutura e função em resposta a uma extensa tal alteração na experiência. Existem diferentes métodos de privação visual e todos eles têm suas vantagens específicas em pesquisas relacionadas à visão. Por exemplo criação escuro especificamente elimina impulsionado visualmente atividade, no entanto, não afeta a atividade da retina espontâneo. Da mesma forma, suturas tampa ou tapa-olhos remover modelada vil entrada sem perturbar a atividade espontânea, mas eles permitem a penetração da luz dispersa através dos olhos fechados. Esses métodos são reversíveis e têm mostrado ser úteis para a compreensão do papel de visão e de baixo nível de correlação modelado de entradas binocular em esculpir circuitos corticais durante o desenvolvimento 6-8. Na pesquisa de glaucoma, o modelo de esmagamento do nervo óptico em animais adultos, tem sido amplamente utilizado porque estabelece uma perda progressiva das entradas de células do gânglio retinal que formam o nervo óptico 9,10. Por outro lado, a enucleação, em que o olho e a retina é completamente removido e, instantaneamente, é a escolha apropriada de privação quando o objectivo é o de remover irreversivelmente visão tanto espontânea e modelado de uma só vez. Ela induz também um desequilíbrio actividade intra-ocular robusta que pode melhorar a relação sinal-ruído em estudos de mapeamento de actividade 11,12. Comparando as mudanças funcionais e estruturais em resposta a enucleação com those após a privação por métodos menos drásticas, como sutura tampa por exemplo, também pode expor novos insights sobre o papel da atividade da retina espontâneo em ambos os tipos de homeostase e de plasticidade sináptica. Enucleação desencadeia uma perda de influências tróficas em alvos diretos da retina. Por exemplo, os níveis de BDNF são significativamente downregulated no núcleo lateral geniculado (LGN) e colículo superior de ratos adultos enucleadas 13. Espécies reativas de oxigênio, que funcionam como moléculas mensageiras para mediar remodelação estrutural, também foram detectados em estruturas subcorticais do rato adulto sistema visual 14. Além disso, microglia e ativação astrocitária através de diferentes estruturas alvo visuais subcorticais no rato ocorrer em um período de tempo pós-enucleação específico de uma semana 15. Juntos, os resultados desaferentação ópticas em diferentes respostas subcorticais no glial, nível estrutural e molecular. Apesar destes subcorticalefeitos, não implica necessariamente efeitos no nível cortical 16. Notável, plasticidade cortical inter-modal, incluindo modificações em outras áreas sensoriais ao lado do fortalecimento de insumos não-visuais para o córtex visual privados ocorrer após tanto monocular (ME) 3,4,17,18 e binocular (BE) 1,17 enucleação. Para além de contribuir para neuroscience visual, enucleação como um tipo de desaferentação pode ser utilizado para estudar o equilíbrio entre a 19 neuroprotectores e neurodegenerativos 20-22 propriedades do sistema nervoso central. Diferentes procedimentos para realizar a enucleação já descritos na literatura. Certas metodologias para in vivo ME em ratos e camundongos são menos simples devido ao corte desnecessário de músculos orbitais e tecido 23-25. Outras publicações, tais como Mahajan et al (2011) 5. Fornecer um protocolo detalhado usando<html> dissecção romba para uma coleção de alto rendimento de olhos para estudar as correlações genótipo-fenótipo, provavelmente post-mortem. Para a sua finalidade, o método é rápido e conveniente. No entanto, este método é menos adequado para visualização in vivo, quando se opta enucleação para estudar o caminho visual aferentes a seguir a enucleação (em animais vivos) em vez do próprio olho. Em tal cenário, a sobrevivência pós-enucleação é de grande importância. Além disso, um mínimo de danos vivo e preservação do nervo óptico e do tecido orbital é favorável. Aqui, nós apresentamos um método alternativo enucleação, mais semelhante ao descrito por Faguet et al (2008) 26, que oferece certas propriedades vantajosas:. Está associado com uma recuperação pós-operatória rápida e é caracterizado por um limite muito baixo de aprendizagem para os pesquisadores. Em geral, os métodos são complementares diferentes dependendo do foco de pesquisas subsequentes: morfologia do olho ou de investigação via visual. ve_content &quot;&gt; Em suma, a enucleação pode ser aplicado a partir de pesquisas de visão para investigações de plasticidade homeostática e cross-modal cérebro, propriedades de resposta da glia, e estabilidade axônio. Neste artigo visualizados, demonstramos um método viável e confiável para in vivo enucleação do olho em o mouse.

<table><tbody><tr><td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td><td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td><td>BE-V136516</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td><td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td><td>BE-V151742</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td><td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td><td>BE-V153352</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics (cefazolin, Kefzol)</td><td>Eurocept Pharmaceuticals</td><td>BE 106267</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (Fucithalmic)</td><td>Leo Pharma nv-sa</td><td>BE 144654</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps - curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Hemostatic cotton wool</td><td>Qualiphar</td><td>N/A</td><td>Other hemostatic agents are equally suitable (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Viscostat, #649, Ultradent Products)</td></tr></tbody></table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

Enucleação ou a remoção cirúrgica de um olho pode ser geralmente considerado como um modelo para deaferentação nervo. Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudar os diferentes aspectos do visual, cross-modal e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos 1-4. Aqui, demonstramos uma técnica elegante e simples para a remoção de um ou ambos os olhos no rato, que é validado em ratinhos de 20 dias de idade até adultos. Resumidamente, um desinfectadas pinças curvas é utilizado para fixar o nervo óptico atrás do olho. Subsequentemente, os movimentos circulares são realizadas para comprimir o nervo óptico e retirar o globo ocular. As vantagens desta técnica são de alta reprodutibilidade, o mínimo de sangramento, recuperação pós-operatória rápida e um limiar de aprendizagem muito baixo para o experimentador. Assim, uma grande quantidade de animais pode ser manipulado e processado com uma quantidade mínima de esforço. A natureza da técnica pode induzir danos ligeiros ada retina durante o procedimento. Este efeito secundário torna este método menos adequado em comparação com Mahajan et al. (2011) 5, se o objetivo é coletar e analisar tecido da retina. Além disso, o nosso método é limitado a pós-olho abrindo as idades (rato: P10 - 13 em diante) desde o globo ocular precisa ser deslocado do soquete sem a remoção das pálpebras. A técnica in vivo enucleação descrito neste manuscrito foi recentemente aplicado com êxito com modificações menores em ratos e parece útil para o estudo da via visual aferente de roedores em geral.

A Figura 1 ilustra a remoção bem sucedida do olho, utilizando o protocolo descrito e é caracterizado pela ausência de sangramento ou danos físicos aparentes para o tecido orbital ou cavidade ocular (Figuras 1A, 1B). Além disso, o olho tem uma córnea removido suave, coróide e disco óptico, indicativo de um globo completamente intacto (Figura 1C). Uma vez que o nosso protocolo engloba o aperto do nervo óptico por trás do olho e viragem mecânica, o nervo óptico do olho é removida constrito na base da retina (Figura 1E). Realizando os resultados do procedimento descrito em um nervo óptico clean-cut, sem qualquer dano para a área cerebral circundante (Figura 1E). Enucleação monocular, em combinação com o mapeamento de actividade (Figura 2), permite delinear acentuadamente as regiões funcionais de entrada ou no olho específicos vi contralaterall córtex do rato 12,27 ou colunas de dominância ocular mesmo em mamíferos de ordem superior, como macacos 28. Em experiências com ratos, a remoção de um (ME) ou ambos os olhos (SER) combinado com estimulação visual alvejado e a detecção de ARNm de Zif268 ou c-Fos níveis de expressão da proteína foi aplicado para detectar a activação neuronal regional, no córtex visual 12,27 . Em contraste com controles estimulados visualmente (Figura 2A), seja camundongos mostraram atividade basal no córtex visual devido à completa falta de input visual (Figura 2B). Como tal, as fronteiras entre o córtex visual com não-visual (ie. Córtex somatossensorial em mais seções anterior e córtex auditivo em mais seções posteriores) foram descobertos. Os resultados do ME camundongos com um tempo de sobrevivência de uma semana visualizados nas regiões de entrada específicos olho no córtex visual contralateral. As duas regiões foram acionados monocularmente hipoativo e localizado mediai e lateral da zona binocular central (Figura 2C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 avaliação qualitativa do estado pós-enucleação da cavidade ocular, o olho removido eo nervo óptico. Após a remoção do olho com uma pinça curva (A) sem sangramento ou dano é observado na cavidade ocular (B). O olho removido é completamente intacto como refletido por uma aparência normal da córnea e coróide (C, D). O nervo óptico, é constrangido no disco óptico onde sai o olho (D). A análise da parte ventral do cérebro revela um nervo óptico de corte limpo (asterisco) e nenhum dano aparente para outras estruturas (E). Barras de escala em C, D: 1 mm. Barra de escala em E: 5 milímetros. A: anterior; L: esquerda; P: posterior; R: direita. Figura 2 subdivisões específicas olho-entrada funcionais no córtex visual do rato como reveladas por enucleação. Linhas pretas e cinzas que conectam os olhos eo córtex representam a travessia dos aferentes da retina e as regiões de entrada específicos do olho. A atividade neural é visualizada em cortes coronais de controle (A), BE (B) e ME (C) ratos por radioativo hibridização in situ (ISH) para Zif268 (escala de cinza) em torno do nível Bregma -3,40 mm. Em animais de controlo (A), o córtex visual em ambos os hemisférios expressa elevada actividade no seguimento da estimulação visual. Quando um ou ambos os olhos (s) são extirpados, uma clara diminuição na actividade do sinal é visível nas correspondentes regiões corticais privadas. Monocularmente enucleados (C) ratos mostram uma zona de alta actividade na zona binocular do córtex visual rodeado por uma diminuição de sinal em zonas monoculares contralateral ao olho removido. Barra de escala: 2 mm. Reproduzido com a permissão de Van Brussel et al 12.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.

Um método altamente reprodutível e fácil de executar<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

a-highly-reproducible-straightforward-method-to-perform-vivo-ocular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.2K visualizações.  KU Leuven - University of Leuven.  A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação. 

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Medicina

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Vídeo oculografia-in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neurociência

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biologia

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the cortex to the contralateral eye to a stimulus is much stronger than the response of the ipsilateral eye in the binocular segment of the mouse primary visual cortex (V1). During the mammalian critical period, suturing the contralateral eye will result in a rapid loss of responsiveness of V1 cells to contralateral eye stimulation. With the continuing development of transgenic technologies, more and more studies are using transgenic mice as experimental models to examine the effects of specific genes on ocular dominance (OD) plasticity. In this study, we introduce detailed protocols for monocular visual deprivation and calculate the change in OD plasticity in mouse V1. After monocular deprivation (MD) for 4 days during the critical period, the orientation tuning curves of each neuron are measured, and the tuning curves of layer four neurons in V1 are compared between stimulation of the ipsilateral and contralateral eyes. The contralateral bias index (CBI) can be calculated using each cell&#39;s ocular OD score to indicate the degree of OD plasticity. This experimental technique is important for studying the neural mechanisms of OD plasticity during the critical period and for surveying the roles of specific genes in neural development. The major limitation is that the acute study cannot investigate the change in neural plasticity of the same mouse at a different time.

Here, we present detailed protocols for monocular visual deprivation and ocular dominance plasticity analysis, which are important methods for studying the neural mechanisms of visual plasticity during the critical period and the effects of specific genes on visual development.

Privação Visual Monocular e Medição de Plasticidade de Dominação Ocular no Córtex Visual Primário do Camundongo

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

Biologia do Desenvolvimento

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protocolos de danos às fibras sensoriais da córnea para estudos de regeneração de axônios

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de inervação da córnea por meio de modelos inovadores 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Microdissection of the Rodent Eye

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, to obtain the anterior and posterior eyecups. With this technique, the sub-parts of the eye, including the corneal tissue, neural tissue, retinal pigment epithelial (RPE) tissue, and lens, can be obtained for wholemounts, cryo-sectioning, and/or single-cell suspensions of a specific ocular tissue. The presence of the third eyelid presents unique and significant advantages, as it benefits the maintenance of the orientation of the eye, which is important for understanding eye physiology following any localized intervention or in studies involving ocular analysis relating to the eye&#39;s spatial topography.
In this method, we enucleated the eyeball at the socket along with the third eyelid by carefully and slowly cutting through the extraocular muscles and severing the optic nerve. The eyeball was pierced through the corneal limbus using a microblade.&#160;The incision was used as the point of entry, allowing for cutting along the corneal-scleral junction by inserting micro-scissors through the incision point. Small and continuous cuts along the circumference were made until the cups separated. These could be further dissected by gently peeling the translucent layer of the neural retina using Colibri suturing forceps to obtain the neural retina and RPE layers. Further, three/four equidistant cuts were made from the periphery perpendicularly to the optic center until the optic nerve was reached. This opened the hemispherical cups into a floret shape so that they fell flat and could be easily mounted. This technique has been used in our lab for corneal wholemounts and retinal sections. The presence of the third eyelid delineates the nasal-temporal orientation, which allows for the study of various cell therapy interventions post-transplantation and, thus, the targeted physiological validation vital for visualization and accurate representation in such studies.

This paper presents a protocol for ocular micro-dissection in rodents. The process involves the enucleation of the eyeball along with the nictitating membrane (i.e., the third eyelid). This is then followed by the separation of the posterior and anterior eye cups.

Microdissecção do olho de roedores

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Um método altamente reprodutível e fácil de executar

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Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

Vídeo oculografia-in Mice

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

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Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

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Microdissecção do olho de roedores