A pesquisa ocular nos primeiros tempos dependia principalmente do tecido ocular de indivíduos falecidos. No entanto, ao longo dos anos, muitos modelos oftálmicos de roedores foram desenvolvidos e a necessidade de tecido ocular humano diminuiu. Devido ao pequeno tamanho e à área limitada de operações no olho do roedor, o acesso efetivo às subpartes oculares é severamente restrito.
Normalmente, para operar o olho de um roedor, o olho é imobilizado através do nervo óptico e a dissecção é realizada. Esta prática é árdua e pode danificar o tecido frágil à medida que o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica no isolamento das várias seções das camadas da retina, esta técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção do tecido.
Além disso, uma intervenção direcionada é difícil de localizar após a dissecção devido à montagem celular homogênea do copo ocular posterior e anterior. Neste vídeo, um método cirúrgico modificado para microdissecção é demonstrado. A presença da membrana nictitante anexada, ou a terceira pálpebra, apresenta vantagens únicas e significativas.
Neste método, primeiro o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra, em seguida, a terceira pálpebra é usada para imobilizar o olho. É seguido por piercing do globo ocular através do limbo da córnea, e a incisão é usada como ponto de entrada. Em seguida, cortando ao longo da circunferência, os copos oculares anterior e posterior são separados.
Ao dissecar ainda mais o copo ocular posterior, a camada translúcida da retina neural é identificada e suavemente descascada. As camadas neurais e RPE são assim obtidas para processamento posterior. A terceira pálpebra nos permitirá demarcar a orientação espacial do olho pós-enucleação.
Vamos agora seguir o procedimento passo-a-passo detalhado. Dilate os olhos dos roedores usando uma gota de soluções oftálmicas de 0,8% de tropicamida e 5% de fenilefrina e coloque o animal em uma área escura por 30 minutos antes do procedimento. Eutanasiar o animal administrando por via intraperitoneal cinco vezes doses de anestesia.
Uma dose típica é de 200 microlitros PBS contendo 10 mg de cetamina e um mg de xilazina. Confirme a completa falta de resposta ao estímulo examinando o reflexo do pedal. Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho.
Mantenha uma pinça de sutura Colibri, uma pinça curva, uma microlâmina de 15 graus de tamanho de três milímetros, microtesoura de mola e uma microtesoura de mola angular pronta para o procedimento. Coloque uma pinça curva ao redor do globo ocular e aperte para libertar o olho de anexos estranhos. A terceira pálpebra, também conhecida como membrana nictitante, está localizada no canto superior da tangente nasal e pode ser identificada como uma protuberância translúcida menor com limites pigmentados.
Em seguida, use uma microtesoura de mola e corte ao redor do globo ocular. Cortes pequenos e contínuos liberam o globo ocular dos anexos esclerais. Coloque uma microtesoura de mola curva sob o globo ocular para liberar o olho, cortando o nervo óptico.
Coloque o olho enucleado em uma placa de Petri contendo tampão PBS de tal forma que o globo ocular esteja submerso em PBS. Alguns músculos ou tecidos extraoculares começarão a flutuar para longe do globo ocular. Removê-los, cortando-os do globo ocular usando micro-tesouras de mola.
Em seguida, remova o nervo óptico da base do globo ocular para permitir uma melhor separação da retina para preparações completas. Não é necessário remover o nervo óptico para a secção do tecido. Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5 ml contendo um ml de paraformaldeído a 4% ou PFA.
Mantenha-o por duas horas a quatro graus Celsius para fixação do tecido. É possível fazer uma pausa nesta etapa, deixando o tecido em PFA por até 12 horas a quatro graus Celsius. No entanto, para o isolamento de células vivas, as etapas de fixação não devem ser realizadas e todo o procedimento precisa ser realizado em contínuo.
Após a fixação do PFA, transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo PBS e coloque-o sob um microscópio de dissecação para realizar o procedimento subsequente. Imobilize o globo ocular segurando a terceira pálpebra firmemente com pinça de sutura de Colibri. O limbo é a junção escleral da córnea.
Faça uma pequena incisão no limbo, perfurando-o usando uma microlâmina. A incisão é feita preferencialmente oposta à terceira pálpebra. Em seguida, usando esta incisão como ponto de partida, com a microtesoura fazer pequenos e contínuos cortes ao longo desta circunferência do limbo escleral corneano.
Primeiro, complete um semicírculo de cortes a partir do ponto de incisão até a terceira pálpebra. Em seguida, complete o semicírculo restante de cortes do outro lado. Finalmente, faça um corte ao redor da terceira pálpebra para separar o copo posterior e o anterior.
Remova o cristalino do copo posterior usando fórceps para obter o copo posterior composto pela retina neural e camada de EPR e o copo anterior da córnea. Se trabalhar com tecidos não fixos, os copos anterior e posterior agora podem ser digeridos enzimaticamente para obter suspensão unicelular da córnea ou da retina. Para fixar os tecidos, transfira esses copos para um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA a 4% por 12 horas a quatro graus Celsius.
Após a fixação, o tecido pode ser incorporado em meio apropriado e criossecção ou seccionamento de parafina pode ser feito para obter cortes de córnea ou retina. Reintroduza o copo posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Uma camada opaca na camada de PSE pigmentada é a retina neural.
Descasque a retina neural usando uma segunda pinça. Um movimento muito suave e leve da mão é altamente recomendado para não danificar o tecido. Na saída do nervo óptico, a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural, e um corte pode ser feito para liberar completamente as camadas se a retina neural permanecer ligada.
A retina também pode ser liberada ou destacada, acariciando-a suavemente com uma escova macia. Reintroduzir os copos anterior e posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Use uma mola angular micro-tesoura para fazer um corte ao lado da terceira pálpebra da periferia perpendicularmente em direção ao centro óptico.
Mantenha um aperto da terceira pálpebra e faça um corte ao lado do primeiro corte. Faça um corte semelhante entre o segundo corte e a terceira pálpebra. Três ou quatro desses cortes equidistantes abrem os copos hemisféricos em forma de flor, que cai plana e pode ser facilmente montada.
Não faça cortes muito profundos até o centro do copo, pois isso pode fazer com que as seções das folhas se desintegrem ou se separem facilmente. O meio líquido permite que o copo do olho anterior atinja uma estrutura curva. Siga os mesmos passos dados para fazer cortes no copo posterior para fazer três ou quatro cortes equidistantes no copo anterior.
Os tecidos estão agora prontos para novas colorações. Nesta figura, todo o monte de copo anterior é mostrado. O tecido corneano foi microdissecado conforme descrito para revelar os vasos linfáticos no tecido conjuntival anexado do folheto corneano.
Nesta figura, todo o monte de retina neural é mostrado. A vasculatura retiniana da retina neural foi corada com isopectina e é visível como vasos verdes. Neste método, o globo ocular enucleado dos ratos é obtido com a terceira pálpebra anexada para um manuseio eficaz e fácil.
A terceira pálpebra imobiliza completamente o globo ocular e permite que a dissecção prossiga com facilidade e erros mínimos. Este método é vantajoso para seccionamento específico de tecido ocular, análise de célula única e montagens inteiras. No entanto, a necessidade de fixação tecidual repetitiva torna o tecido inviável para a cultura de células ou tais necessidades de células vivas.
Assim, o procedimento precisa ser realizado em continuum para o isolamento de células vivas.
