We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Alle Experimente wurden von der ethischen Forschungsausschuss der KU Leuven zugelassen und waren in strikter Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie des Rates vom 22. September 2010 (2010/63 / EU) und mit der belgischen Gesetzgebung (KB vom 29. Mai 2013). Jede mögliche Anstrengung wurde gemacht, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der Tiere zu reduzieren. 1. Tier Behandlung und Anästhetika <ol><li> Betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (75 mg / ml) und Medetomidin-Hydrochlorid (1 mg / kg) in Salzlösung. </li><li> Überprüfen Sie die Reflexe durch Kneifen Sie die Zehen mit einer Pinzette, um sicherzustellen, die Maus ist komplett sediert. </li><li> Gelten 70% Ethanol, die Augenlider und die Region rund um das Auge mit einem Wattestäbchen zu desinfizieren. Überprüfen Sie das Augenlid Reflex zusätzlich beurteilen den Grad der Sedierung. </li></ol> 2. Entfernen der Augen <ol><li> Stellen Sie sicher, das Tier befindet sich auf einem ebenen, trockenen undglatte Oberfläche. </li><li> Sterilisieren eine Zange mit einer gebogenen, gezackten Spitze (bevorzugt Spitzengröße: 0,5 x 0,4 mm). </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf die Augenwinkel (Augenwinkel) mit der Zange, bis der Augapfel aus der Steckdose verdrängt und der Sehnerv erreichbar ist. </li><li> Führen Sie die Zange hinter dem Auge. Drücken und halten Sie den Sehnerv fest, vorzugsweise mit dem Beginn der Kurve und nicht der Spitze der Zange. Dies wird helfen, die Welt aus der Steckdose zu heben und die komplette Sehnerv klemmen. </li><li> Machen Sie kreisende Bewegungen mit der Hand, die Zange in der Richtung mit dem geringsten Widerstand, während die Maus auf der flachen Oberfläche bleibt. Die Maus wird entlang der Oberfläche schwingt entsprechend der Richtung der Bewegung der Hand. </li><li> Führen diese Aktion mit allmählich zunehmender Geschwindigkeit, bis der Sehnerv in zwei schnürt (in der Regel zwischen 7 bis 15 Kreisbewegungen, etwa eine halbe bis eine volle Umdrehung pro Sekunde). Daher ist die freistehende Augapfelentfernt. </li></ol> 3. post-operative Betreuung <ol><li> Im Falle von Blutungen (selten), füllen die Umlaufbahn mit einer viskosen Koagulat und blutstillendes Mittel. </li><li> Kehren Sie die Anästhesie durch Injektion von 1 mg / kg atipamezol Hydrochlorid in Kochsalzlösung intraperitoneal. </li><li> Verwalten 1 mg / kg Meloxicam intraperitoneal alle 24 Stunden, um Schmerzen zu lindern. </li><li> Augensalbe anwenden, um den verbleibenden Auge zu Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. </li><li> Lassen Sie das Tier zurück auf einer Heizplatte oder wickeln Sie das Tier in Isoliermaterial in einem separaten Käfig, um die Körpertemperatur zu steuern. </li><li> Messen des Gewichts der Maus jeden Tag für mindestens 2 Tage. Gewichtsverlust kann Leiden zeigen und in diesem Fall weiterhin Meloxicam Behandlung, bis das Tier vollständig wiederhergestellt wird. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um eine erfolgreiche Enukleation nach unserer Methode durchzuführen, die wichtigsten Schritte zu beachten sind: 1) mit einer Pinzette mit gebogener Spitze und gezackten der entsprechenden Größe; 2) die Durchführung der Enukleation auf eine glatte und trockene Oberfläche; und 3) nach und nach die Beschleunigung der kreisenden Bewegungen in die Richtung mit der geringsten Reibung. Für eine effektive Ergebnis ist es wichtig, den geeigneten Zange gekennzeichnet durch einen gekrümmten und gezackten Spitze verwenden (bevorzugte Spitze Größe: Maus: 0,5 x 0,4 mm; Ratte: 2,15 x 1,3 mm). Die Krümmung ermöglicht eine gute Anbindung an den Sehnerv nach Augapfel Hubraum und ist für die korrekte Platzierung der Hand notwendig, wenn die Durchführung der kreisenden Bewegungen. Glatte Tipps sind nicht zu empfehlen, da sie nicht die notwendige Griff, wenn die Sehnerven. Wird der Sehnerv in den kreisenden Bewegungen richtig zu halten führt zu Bruch der Augenarterie, schlechte Ablösung des Auges und damit schlechte Reproduzierbarkeit.Daher ist es zum ersten Training am eingeschläfert Tiere für die Optimierung der Zange Handhabung, um eine maximale Tierschutz einmal die Anwendung der Methode in vivo zu gewährleisten wird empfohlen, diese Technik. Erfolgreicher Augen Enukleation kürzlich auch in der Ratte in unserem Labor unter Verwendung der gleichen Technik mit Ausnahme der Drehung des Tierkörpers manuell und halten die stationären Zange durchgeführt. Eine Einschränkung der Technik ist, dass es möglicherweise die Netzhaut schädigen. Daher ist diese Methode für das Sammeln von Netzhaut der Histologie 5 ausführen weniger geeignet. Darüber hinaus ist unser Verfahren beschränkt auf Augenöffnung Alter veröffentlichen, da der Augapfel muss aus der Steckdose verlagert werden, ohne das Abtragen oder Schneiden die Augenlider. Augen Enukleation in verschiedenen Arten, einschließlich Nagetiere, wird routinemäßig unter Verwendung von alternativen Verfahren, die häufig zur Folge der Entfernung der Augenlider und Schneiden des Sehnervs 18,23-25. Diese Methods sind eher invasiv und haben eine höhere Lernkurve als die hier beschriebenen Technik. Ohne die Notwendigkeit zur Entfernung oder Vernähen der Augenlider, die nach der Operation Wiederherstellungszeit minimiert, was zu höheren Tierschutz und mehr reproduzierbare Ergebnisse.

Entfernen Sie ein Auge und damit irreversibel zerstörende die sensorische Empfangsfläche (Retina), erlegt einen erheblichen Verlust der sensorischen Eingangs entlang der Sehbahn. Die Enukleation Modell in der jugendlichen und erwachsenen visuelle System hat sich bewährt in das Verständnis der Entwicklung, Plastizität und Funktion der verschiedenen visuellen Zentren 1-4 sein. Die molekularen, zellulären und physiologischen Folgen dieser sensorische Deprivation kann Einblicke in die normale Entwicklung, wie reguliert wird und wie etablierte kortikalen Schaltkreisen zu bewältigen und ändern ihre Struktur und Funktion in Reaktion auf eine solche umfassende Veränderung in der Erfahrung. Verschiedene Methoden der visuellen Deprivation existieren und sie alle haben ihre spezifischen Vorteile in der Vision-Forschung haben. Zum Beispiel dunkel Aufzucht spezifisch eliminiert visuell getrieben Aktivität noch berührt sie nicht die spontane Netzhautaktivität. Ebenso Deckel Nähte oder Augenklappen entfernen gemusterten Visualisierungsl Eingabe ohne Spontanaktivität zu stören, sondern sie ermöglichen verteilten Lichteinfall durch die geschlossenen Augen. Diese Methoden sind reversibel und haben gezeigt, dass wertvolle für das Verständnis der Rolle der gemusterten Vision und Low-Level-Eingänge Korrelation von Fernglas in Bildhauerei kortikalen Schaltkreisen während der Entwicklung 6-8 sein. In der Glaukomforschung, hat der Sehnerv verknallt Modell bei erwachsenen Tieren weit verbreitet, weil es wird ein fortschreitenden Verlust von retinalen Ganglienzelle Eingänge, die den Sehnerv bilden 9,10. Auf der anderen Seite, Enukleation, wo das Auge und damit die Retina vollständig und sofort entfernt wird, ist die geeignete Wahl der Benachteiligung wenn das Ziel ist, irreversibel zu entfernen sowohl spontan als auch strukturierte Sicht auf einmal. Es induziert auch eine robuste intraokularen Aktivität Ungleichgewicht, welches das Signal-Rausch-Verhältnis der Aktivität Kartierungsstudien 11,12 erweitern kann. Vergleichen funktionellen und strukturellen Veränderungen in Reaktion auf Enukleation mit those nach Entzug von weniger drastischen Methoden wie Deckel Naht zum Beispiel, könnte auch neue Einblicke in die Rolle der spontanen Aktivität der Netzhaut in beiden homöostatischen und synaptische Plastizität Typen aus. Enukleation löst einen Verlust der trophischen Einflüsse in direkter Netzhaut Ziele. So sind beispielsweise BDNF-Spiegel signifikant in der seitlichen Kniehöcker (LGN) und Colliculus superior der erwachsenen Ratten entkernte 13 herunterreguliert. Reaktive Sauerstoffspezies, die als Botenstoffe fungieren, um strukturelle Umbau zu vermitteln, wurden auch in subkortikalen Strukturen der erwachsenen Ratte visuelle System 14 erfasst. Außerdem Mikroglia und Astroglia-Aktivierung in verschiedenen subkortikalen visuellen Zielstrukturen in der Maus treten in einem bestimmten Post-Ausschälung Zeitrahmen von einer Woche 15. Zusammen, Optik Deafferentation Ergebnisse in verschiedenen subkortikalen Reaktionen an der Glia, strukturellen und molekularen Ebene. Trotz dieser subkortikalenEffekte, bedeutet dies nicht zwangsläufig implizieren Wirkungen an der kortikalen Ebene 16. Bemerkenswert, verkehrsträgerübergreif kortikale Plastizität, einschließlich Änderungen in anderen Sinnesbereichen neben der Stärkung der nicht-visuelle Eingänge zum beraubt visuellen Kortex auftreten, nachdem sowohl monokulare (ME) 3,4,17,18 und Fernglas (BE) 1,17 Enukleation. Neben dem Beitrag zur visuellen Neurowissenschaften, können Enukleation als eine Art Deafferentation verwendet werden, um die Balance zwischen neuroprotektiven 19 und neurodegenerative 20-22 Eigenschaften des zentralen Nervensystems zu untersuchen. Verschiedene Verfahren zur Enukleation durchführen, sind bereits in der Literatur beschrieben. Bestimmte Methoden zur in-vivo-ME bei Ratten und Mäusen sind weniger einfach durch unnötige Schnitte Orbital Muskeln und Gewebe 23-25. Andere Publikationen wie Mahajan et al. (2011) 5 eine detaillierte Protokoll mit<html> stumpf für ein Hochdurchsatz-Sammlung von Augen, die Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, wahrscheinlich post-mortem zu studieren. Für ihren Zweck, ist das Verfahren schnell und bequem. Jedoch ist dieses Verfahren für die In-vivo-Enukleation weniger geeignet, wenn man entscheidet, den afferenten Sehbahn folgenden Enukleation (in lebenden Tieren) anstelle des Auges selbst zu studieren. In einer solchen Umgebung ist von großer Bedeutung, post-Enukleation Überleben. Auch minimale Schäden in vivo und die Erhaltung der Sehnerv und Augenhöhlengewebe ist günstig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode Enukleation, mehr ähnlich dem von Faguet et al (2008) 26, dass bestimmte vorteilhaften Eigenschaften bietet:. Sie mit einer schnellen postoperativen Erholung verbunden ist und sich durch eine sehr niedrige Schwelle Lern gekennzeichnet für Forscher. Im Allgemeinen sind die verschiedenen Methoden ergänzen je nach Schwerpunkt der späteren Forschung: Augen Morphologie oder Sehbahn Forschung. ve_content &quot;&gt; In der Summe kann Ausschälung von der Vision der Forschung auf Untersuchungen von Homöostase und Cross-modale Plastizität des Gehirns, Glia-Antworteigenschaften und Stabilität Axon angewendet werden. In diesem visualisiert Artikel zeigen wir eine praktikable und zuverlässige Methode zur in-vivo-Augen Enukleation in die Maus.

<table><tbody><tr><td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td><td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td><td>BE-V136516</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td><td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td><td>BE-V151742</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td><td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td><td>BE-V153352</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics (cefazolin, Kefzol)</td><td>Eurocept Pharmaceuticals</td><td>BE 106267</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (Fucithalmic)</td><td>Leo Pharma nv-sa</td><td>BE 144654</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps - curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Hemostatic cotton wool</td><td>Qualiphar</td><td>N/A</td><td>Other hemostatic agents are equally suitable (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Viscostat, #649, Ultradent Products)</td></tr></tbody></table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

Enukleation oder die chirurgische Entfernung eines Auges kann in der Regel als Modell für Nerven Deafferentation berücksichtigt werden. Es stellt ein wertvolles Instrument, um die verschiedenen Aspekte der visuellen, Cross-modale Plastizität und Entwicklungs entlang der Säugetier-visuelle System 1-4 zu studieren. Hier zeigen wir, eine elegante und einfache Methode zur Entfernung von einem oder beiden Augen der Maus, die in den Mäusen 20 Tage alt bis zu Erwachsenen validiert wird. Kurz gesagt wurde eine desinfizierte gebogenen Pinzette wird verwendet, um den Sehnerv hinter dem Auge zu klemmen. Anschließend werden kreisende Bewegungen durchgeführt, um den Sehnerv zu verengen, und entfernen Sie den Augapfel. Die Vorteile dieser Technik sind eine hohe Reproduzierbarkeit, minimale bis keine Blutung, rasche postoperative Erholung und eine sehr geringe Lernschwelle für den Experimentator. Daher kann eine große Menge von Tieren manipuliert und mit minimalem Aufwand verarbeitet werden. Die Art der Technik kann leichte Schäden zu verandie Netzhaut während des Verfahrens. Diese Nebenwirkung ist diese Methode weniger geeignet, da im Vergleich zu Mahajan et al. (2011) 5, wenn das Ziel ist, zu sammeln und zu analysieren, Netzhautgewebe. Auch ist unsere Methode zur postAugenÖffnung Altersgruppen (Maus: P10 - 13 an) beschränkt, da der Augapfel muss aus der Steckdose, ohne die Augenlider zu entfernen verschoben werden. Die in diesem Manuskript beschrieben in vivo Enukleation Technik wurde kürzlich erfolgreich mit geringfügigen Änderungen bei Ratten angewendet und scheint sinnvoll, die afferenten Sehbahn von Nagetieren im allgemeinen zu studieren.

Figur 1 veranschaulicht die erfolgreiche Entfernung des Auges unter Verwendung des beschriebenen Protokolls und wird durch das Fehlen von Blutungen oder einem scheinbaren physikalischen Beschädigung der Orbitalgewebe oder die Augenhöhle (1A, 1B) ist. Darüber hinaus hat das Auge entfernt eine glatte Hornhaut, Aderhaut und Optical Disc, deutet auf einen völlig intakten Welt (Abbildung 1c). Da unser Protokoll umfasst die Klemmung der Sehnerv hinter dem Auge und mechanische Dreh ist der Sehnerv des Auges entfernt verengten an der Basis der Netzhaut (1D). Durchführung der beschriebenen Vorgehensweise führt zu einem sauberen Schnitt Sehnerv, ohne Schäden an der umgebenden Hirnbereich (1E). Monokularen Enukleation in Kombination mit Aktivität Mapping (Abbildung 2), ermöglicht es, die Funktions scharf abzugrenzen oder Augen spezifischen Eingabebereiche in der kontralateralen Visualisierungsl Kortex der Maus 12,27 oder sogar Augendominanz Spalten in höherer Ordnung Säugetiere wie Affen 28. In Experimenten mit Mäusen, die Entfernung von einem (ME) oder beider Augen (BE) mit gezielten visuellen Stimulation und der Detektion von mRNA oder Zif268 c-Fos Protein-Expressionsniveaus kombiniert angewendet, um regionale neuronale Aktivierung in der Sehrinde 12,27 aufzudecken . Im Gegensatz zu optisch stimulierte Kontrollen (Figur 2A), zeigte BE Mäusen basale Aktivität in der Sehrinde aufgrund mangelnder visueller Eingang (2B) zu vervollständigen. Als solche wurden die Grenzen zwischen bildender mit nicht-visuellen Kortex (dh. Somatosensorischen Kortex bei mehreren vorderen Abschnitte und auditorischen Kortex in mehr hinteren Abschnitte) aufgedeckt. Ergebnisse von ME-Mäusen mit einer einwöchigen Überlebenszeit visualisiert die Augen bestimmte Eingabebereiche in der kontralateralen visuellen Kortex. Die beiden monokular angetrieben Regionen waren hypoaktiven und befindet medial und lateral der Mittel binokularen Zone (2C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Qualitative Bewertung der post-Enukleation Zustand der Augenhöhle, die entfernt Auges und des Sehnervs. Nach Entfernung des Auges mit einer gebogenen Pinzette (A) kein Ausbluten oder Schäden in der Augenhöhle (B) beobachtet. Das entfernte Auge völlig intakt, wie durch einen normalen Erscheinungsbild der Hornhaut und der Aderhaut (C, D) reflektiert wird. Der Sehnerv ist an der Papille, wo es das Auge (D) lässt schnürt. Prüfung der ventralen Teil des Gehirns zeigt eine saubere Schnitt Sehnerv (Stern) und keine sichtbare Beschädigung an anderen Strukturen (E). Maßstabsbalken in C, D: 1 mm. Balken in E: 5 mm. A: vordere; L: links; P: posterior; R: Richtig. Abbildung 2. Funktions Auge-Eingang spezifische Unterteilungen in der Maus visuellen Kortex durch Enukleation enthüllt. Schwarze und graue Linien, die die Augen und Kortex verbinden stellen die Überquerung der retinalen Afferenzen und das Auge bestimmten Eingangs Regionen. Neuronalen Aktivität auf koronalen Abschnitte der Kontrolle (A) visualisiert, BE (B) und ME (C) Mäusen durch radioaktive in situ Hybridisierung (ISH) für Zif268 (Graustufen) um -3,40 mm Bregma Ebene. In Kontrolltieren (A), der visuelle Kortex in beiden Hemisphären drückt eine hohe Aktivität für die visuelle Stimulation. Wenn eine oder beide Auge (n) ausgerottet werden, ist eine klare Abnahme der Aktivität in entsprechenden Signal beraubt kortikalen Regionen sichtbar. Monokular entkernte (C)-Mäuse zeigen eine Zone mit hoher Activität in der binokularen Region des visuellen Kortex durch eine verminderte Signal in den monokularen Zonen kontralateral zu der entfernten Auge umgeben. Maßstab: 2 mm. Mit Genehmigung von Van Brussel et al 12 abgedruckt.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Die Entfernung der Augen, auch als Enukleation, bietet eine nützliche Strategie, um Aspekte der visuellen, Cross-Modal und Entwicklungs Plastizität entlang der Säugetier-visuelle System zu studieren, da es teilweise irreversible induziert (monokulare) oder komplett (Fernglas) Verlust der Sehkraft. Hier beschreiben wir eine hoch reproduzierbare und unkomplizierte Ansatz zur in vivo Enukleation durchzuführen.

Ein hoch reproduzierbare und einfache Methode, um Führen<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enukleation in der Maus nach Augenöffnung

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.2K Aufrufe.  KU Leuven - University of Leuven.  Die Entfernung der Augen, auch als Enukleation, bietet eine nützliche Strategie, um Aspekte der visuellen, Cross-Modal und Entwicklungs Plastizität entlang der Säugetier-visuelle System zu studieren, da es teilweise irreversible induziert (monokulare) oder komplett (Fernglas) Verlust der Sehkraft. Hier beschreiben wir eine hoch reproduzierbare und unkomplizierte Ansatz zur in vivo Enukleation durchzuführen. 

Serie: A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Maus Eye Enukleation für Remote High-throughput Phänotypisierung

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Forschung

Medizin

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Video-Okulographie in Mäuse

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neurowissenschaften

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biologie

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the cortex to the contralateral eye to a stimulus is much stronger than the response of the ipsilateral eye in the binocular segment of the mouse primary visual cortex (V1). During the mammalian critical period, suturing the contralateral eye will result in a rapid loss of responsiveness of V1 cells to contralateral eye stimulation. With the continuing development of transgenic technologies, more and more studies are using transgenic mice as experimental models to examine the effects of specific genes on ocular dominance (OD) plasticity. In this study, we introduce detailed protocols for monocular visual deprivation and calculate the change in OD plasticity in mouse V1. After monocular deprivation (MD) for 4 days during the critical period, the orientation tuning curves of each neuron are measured, and the tuning curves of layer four neurons in V1 are compared between stimulation of the ipsilateral and contralateral eyes. The contralateral bias index (CBI) can be calculated using each cell&#39;s ocular OD score to indicate the degree of OD plasticity. This experimental technique is important for studying the neural mechanisms of OD plasticity during the critical period and for surveying the roles of specific genes in neural development. The major limitation is that the acute study cannot investigate the change in neural plasticity of the same mouse at a different time.

Here, we present detailed protocols for monocular visual deprivation and ocular dominance plasticity analysis, which are important methods for studying the neural mechanisms of visual plasticity during the critical period and the effects of specific genes on visual development.

Monokulare visuelle Deprivation und Ocular Dominance Plastizitätsmessung in der Maus primäre visuelle Kortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...

Microdissection of the Rodent Eye

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, to obtain the anterior and posterior eyecups. With this technique, the sub-parts of the eye, including the corneal tissue, neural tissue, retinal pigment epithelial (RPE) tissue, and lens, can be obtained for wholemounts, cryo-sectioning, and/or single-cell suspensions of a specific ocular tissue. The presence of the third eyelid presents unique and significant advantages, as it benefits the maintenance of the orientation of the eye, which is important for understanding eye physiology following any localized intervention or in studies involving ocular analysis relating to the eye&#39;s spatial topography.
In this method, we enucleated the eyeball at the socket along with the third eyelid by carefully and slowly cutting through the extraocular muscles and severing the optic nerve. The eyeball was pierced through the corneal limbus using a microblade.&#160;The incision was used as the point of entry, allowing for cutting along the corneal-scleral junction by inserting micro-scissors through the incision point. Small and continuous cuts along the circumference were made until the cups separated. These could be further dissected by gently peeling the translucent layer of the neural retina using Colibri suturing forceps to obtain the neural retina and RPE layers. Further, three/four equidistant cuts were made from the periphery perpendicularly to the optic center until the optic nerve was reached. This opened the hemispherical cups into a floret shape so that they fell flat and could be easily mounted. This technique has been used in our lab for corneal wholemounts and retinal sections. The presence of the third eyelid delineates the nasal-temporal orientation, which allows for the study of various cell therapy interventions post-transplantation and, thus, the targeted physiological validation vital for visualization and accurate representation in such studies.

This paper presents a protocol for ocular micro-dissection in rodents. The process involves the enucleation of the eyeball along with the nictitating membrane (i.e., the third eyelid). This is then followed by the separation of the posterior and anterior eye cups.

Mikrodissektion des Nagetierauges

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Eine modifizierte Biopsie-Stanzmethode für präzise alkalische Verbrennungen bei Mäusen

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung zur Behandlung und Regeneration von Hornhauttrübungen 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

Induktion von Hornhaut- und Limbusalkaliverletzungen mit einer Stanz-Trephin-Technik in einem Mausmodell

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

Ein hoch reproduzierbare und einfache Methode, um Führen

Zusammenfassung

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