Células de crista neural craniana tridimensionais in vitro protocolo de diferenciação para ensaio multiplexado

Apresentamos um protocolo de diferenciação in vitro tridimensional (3D) gerando neuroesferas de tamanho reprodutível para produzir células da crista neural craniana a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Mostramos que essa metodologia reduz a variabilidade em comparação com os protocolos anteriores e como ela pode ser usada para ensaios multiplexados para estudar o desenvolvimento das células da crista neural craniana.

Com sua notável capacidade de gerar derivados ectodérmicos e mesenquimais, as células da crista neural craniana (CNCC) têm atraído muito interesse em estudar os mecanismos que regulam as decisões e a plasticidade do destino celular. Originada no neuroepitélio dorsal, essa população de células é transitória e relativamente rara no embrião em desenvolvimento - tornando os testes funcionais, telas genômicas e ensaios bioquímicos difíceis de realizar in vivo. Para superar essas limitações, vários métodos foram desenvolvidos para modelar o desenvolvimento de CNCC in vitro. Os métodos de cultura baseados em neuroesferas (NS) fornecem um microambiente complexo que recapitula o neuroepitélio anterior em desenvolvimento em 3D. Esses sistemas permitem o crescimento de muitos NS na mesma placa para gerar uma grande quantidade de CNCC, mas os NS produzidos apresentam uma alta variabilidade na forma, tamanho e número de CNCC formados - dificultando a realização de ensaios quantitativos. Este protocolo descreve um método reprodutível para gerar NS a partir de células-tronco embrionárias de camundongo (mESC) em um formato de 96 poços. O NS gerado em placas de 96 poços produz células da crista neural craniana (CNCC), que podem ser cultivadas posteriormente. Ao controlar o número de células iniciais, essa abordagem reduz a variabilidade no tamanho e na forma entre os NS e aumenta a reprodutibilidade entre os experimentos. Finalmente, este sistema de cultura é adaptável a várias aplicações e oferece um maior grau de flexibilidade, tornando-o altamente personalizável e adequado para multiplexação de condições experimentais.

As células da crista neural craniana (CNCC) são uma população de células-tronco que surge na parte mais anterior do embrião em desenvolvimento, na fronteira entre a placa neural e o ectoderma de superfície¹. O CNCC então sofre uma transição epitelial para mesenquimal (EMT), delamina do neuroepitélio e migra dorsoventralmente para vários locais do embrião, onde se diferenciam em uma ampla variedade de tipos de células². O estudo dessa população celular é de grande interesse, pois possui uma plasticidade notável³ e a capacidade única de se diferenciar em derivados ectodérmicos e mesenquimais, como ossos e cartilagens craniofaciais⁴. Embora os CNCC sejam relativamente acessíveis no embrião, eles são uma população transitória com baixo número de células, dificultando a realização de estudos mecanísticos sistêmicos in vivo. As linhagens celulares CNCC foram isoladas e caracterizadas nos últimos anos para superar essas limitações. Em particular, a linha celular O9-1 CNCC é uma ótima ferramenta para estudar o desenvolvimento migratório e pós-migratório da crista neural ^5,6; no entanto, esta linhagem celular não permite o estudo dos eventos iniciais anteriores à migração que levam à indução e especificação da crista neural. Nesse sentido, houve desenvolvimentos significativos no desenvolvimento de protocolos de diferenciação in vitro para diferenciar CNCC em uma placa por meio do uso de estruturas 3D semelhantes ao neuroepitélio em desenvolvimento chamadas neuroesferas (NS)^7,8- obtidas após a diferenciação de colônias de células-tronco embrionárias (ESC). Esses protocolos 3D produzem de forma robusta um grande número de CNCC, permitindo a realização de estudos mecanicistas bioquímicos e genômicos ^9,10. Os SN são cultivados em placas de baixa inserção em meio suplementado com N2B27, juntamente com o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF)^10,11 para estimular a proliferação celular. Esses protocolos são realizados em placas de Petri, cultivando-se numerosos NS na mesma placa. Dentro do NS em crescimento, as células se agregam e continuam a se dividir - atingindo um diâmetro de 100-200 μm na maturidade. Na maturidade (por volta do dia 5), os NS se ligam ao substrato e se diferenciam em CNCC semelhantes aos seus equivalentes in vivo ^9,12. Esses CNCC então passam por EMT e delaminam na superfície da placa. Diferenças morfológicas podem ser observadas dependendo do tamanho do SN, pois esferas maiores parecerão mais escuras no núcleo devido à menor disponibilidade de nutrientes e oxigênio, levando as células a sofrerem apoptose¹³. Embora esse tipo de procedimento gere um grande número de CNCC no ponto final da diferenciação, ele apresenta várias limitações, tornando quase impossível o estudo das várias dinâmicas moleculares que ocorrem durante o processo de diferenciação. Primeiro, o uso de colônias ESC - que variam em tamanho - dificulta o controle do número inicial de células para cada experimento. Isso resulta na geração de NS de várias formas e diâmetros que se desenvolvem de maneira diferente, ativando vias de sinalização específicas, levando à diferenciação celular alterada e, portanto, não formando uma amostra uniforme em um determinado momento. Em segundo lugar, a cultura de vários NS na mesma placa geralmente leva à fusão¹⁴ e potencialmente à liberação de moléculas de sinalização que influenciam o microambiente de seus vizinhos e, portanto, seu desenvolvimento. Em conjunto, esses procedimentos geram muita variabilidade entre amostras e experimentos.

Aqui, apresentamos uma estratégia para superar essas dificuldades que geram NS único - capaz de produzir CNCC - agregando ESC de camundongo (mESC) em placas de 96 poços com fundo em U não tratadas com TC. Começar com mESC permite estudar o processo de especificação e os estágios iniciais do desenvolvimento do CNCC em comparação com a partir de linhagens celulares de crista neural já estabelecidas. Este protocolo começa com a desagregação de colônias de mESC para obter uma única suspensão celular, seguida pela semeadura de um número específico de mESC em cada poço de uma placa de 96 poços com fundo em U não tratada com TC. As células são deixadas para agregar por dois dias e, posteriormente, movidas para uma placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC, na qual o NS poderá se ligar ao fundo da placa. Ao controlar o número de células iniciais e o microambiente de cada SN durante o processo de diferenciação, este protocolo reduz a variabilidade da amostra, o que aumenta a reprodutibilidade experimental. Acreditamos que esta será uma plataforma conveniente para projetar experimentos multiplexados, como testar o efeito de diferentes condições de cultura ou realizar telas de perturbação genética.

1. Geração de uma suspensão unicelular a partir de colônias ESC de camundongos

NOTA: Este protocolo é adaptado para o uso de CK35 mESC (uma linha mESC competente para transmissão de linha germinativa, para ter então a opção de desenvolver modelos in vivo ¹⁵) cultivada em alimentadores inativados em uma placa de 6 poços tratada com TC revestida com gelatina. Um poço de uma placa de 6 poços tratada com TC deve render aproximadamente 1,5 × 10⁶ mESC, o que é suficiente para o resto do protocolo. Isso pode ser ampliado, se necessário. Ajuste as etapas iniciais de acordo com a cepa ESC escolhida e o método de cultura de manutenção, bem como o meio de cultura adequado. Este protocolo deve ser realizado em condições estéreis. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Comece com mESC em uma confluência de 70% a 80% cultivada em meio de cultura mESC. Consulte a Tabela 1 para a composição do meio de cultura mESC usada neste estudo.
   NOTA: Não deixe o mESC crescer mais de 80% de confluência, pois eles começarão a se diferenciar e isso afetará o processo de agregação. As colônias devem ser compactas e mostrar uma morfologia saudável (sem rachaduras ou ondas, contraste citoplasmático nuclear distinto).
2. Prepare o meio de diferenciação CNCC. Consulte a Tabela 1 para a composição do meio de diferenciação CNCC.
   NOTA: Uma vez adicionados os fatores de crescimento, o meio pode ser armazenado por até 3 semanas a 4 °C. Certifique-se de que o meio esteja protegido da luz.
3. Preparar uma solução de colagenase fresca a uma concentração de 2 mg/ml no meio DMEM-Knockout.
   NOTA: O uso de colagenase garante que apenas as colônias sejam destacadas e não os alimentadores, pois sua presença nas etapas a seguir interferirá na agregação da SN. Filtre a solução de colagenase antes de usar com um filtro de 0,22 μm.
4. Aspirar o meio ESC de mESC.
5. Adicione suavemente 1 mL de PBS na lateral do poço. Balance o prato suavemente para garantir uma lavagem uniforme.
6. Remova o PBS e substitua por 2 mL de solução de colagenase. Incubar a 37 °C durante 30-45 min.
   1. Verifique a placa sob um microscópio óptico com ampliação de 10x após os primeiros 20 minutos e depois a cada 5 minutos.
   2. Quando as colônias mostrarem bordas enroladas, bata vigorosamente no lado da placa e as colônias se soltarão.
7. Com uma pipeta sorológica de 5 mL, colete as colônias e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL.
   NOTA: Verifique se há colônias restantes na placa sob um microscópio óptico. Estes podem ser coletados com uma lavagem PBS.
8. Centrifugar as colónias a 16 × g durante 3 min à temperatura ambiente (RT).
9. Aspire o máximo de meio possível do tubo cônico, tomando cuidado para não perturbar as colônias no fundo do tubo.
10. Adicione 1 mL de solução de tripsina a 0,05% e incube o tubo a 37 °C por 5 min.
11. Dissocie as colônias no tubo pipetando vigorosamente para cima e para baixo, primeiro com um p1000 e depois com uma micropipeta p200.
    NOTA: Isso garante a obtenção de uma suspensão de célula única.
12. Adicione 2 mL de meio de cultura mESC para bloquear a tripsina e centrifugue a 160 × g por 3 min em RT. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de meio de diferenciação CNCC.
13. Conte as células usando um dispositivo automatizado de contagem de células ou um sistema padronizado sob o microscópio, seguindo as instruções do fabricante.
14. Após a contagem, diluir com meio de diferenciação CNCC suficiente para obter uma concentração de 3000 células vivas por 50 μL.
15. Usando uma micropipeta p200, semeie 50 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U não tratada com TC e, em seguida, encha o poço até 200 μL com meio de diferenciação CNCC.
    NOTA: Ao encher a placa, ressuspenda de vez em quando a suspensão de célula única com uma micropipeta p1000 para obter uma concentração homogênea.
16. Incubar durante a noite em uma incubadora a 37 °C, 5% CO₂.

2. Transferência para uma placa de fundo plano de 96 poços para diferenciação CNCC

1. No dia seguinte (dia 1), observe a placa ao microscópio óptico. Certifique-se de que um pequeno aglomerado de células com bordas claras esteja visível na parte inferior de cada poço. Coloque a placa de volta na incubadora durante a noite.
   NOTA: Pode haver algumas células ao redor do agregado principal, algumas mortas. Isso não interferirá na agregação NS.
2. No dia 2, remova lentamente 100 μL de meio de cada poço.
   1. Ao aspirar meio, tome cuidado para não remover o SN. Para evitar isso, coloque a ponta da pipeta perto da superfície e longe do fundo.
3. Corte a ponta de uma micropipeta p200 a cerca de 3-4 mm da ponta. Use-o para aspirar o NS com o meio restante.
   NOTA: Para facilitar a captação do NS, pipete suavemente para cima e para baixo algumas vezes antes de aspirar.
4. Transfira NS e o meio restante para uma placa de fundo plano de 96 poços não tratada com TC e verifique a transferência sob um microscópio óptico e, em seguida, cubra cada novo poço com 100 μL de meio de diferenciação CNCC pré-aquecido. Deixe NS na incubadora a 37 °C, 5% CO_2, até o dia 4.
5. No dia 4, remova 100 μL de meio de cada poço e substitua-o por 100 μL de meio de diferenciação CNCC pré-aquecido.
   NOTA: Para evitar perturbar a fixação NS na parte inferior da placa, aspire lentamente e substitua o meio.
6. Nos dias 5 e 6, verifique o acessório NS sob o microscópio óptico. Certifique-se de que as células mais leves - delaminadas do NS - comecem a envolver o corpo principal do NS.
7. No dia 7, troque o meio conforme descrito em 2.5. Troque o meio com o mesmo procedimento a cada 2 dias até o ponto final do estudo.

3. Passagem e manutenção do CNCC

NOTA: A passagem do CNCC pode ser realizada assim que houver uma quantidade suficiente de células visíveis ao redor do NS. Isso pode ser já no dia 7, pois os pontos de tempo anteriores não fornecem uma quantidade suficiente de CNCC.

1. Prepare o meio de manutenção CNCC. Consulte a Tabela 1 para a composição do meio de manutenção CNCC.
   1. Antes de adicioná-lo ao meio, filtre o BSA após a solubilização através de um filtro de 0,22 μm. Uma vez adicionados os fatores de crescimento, conservar o meio até 3 semanas a 4 °C. Certifique-se de que o meio esteja protegido da luz.
2. Prepare fibronectina a 7,5 μg / mL em PBS. Misture vigorosamente.
3. Cubra os poços de uma placa de 96 poços não tratada com TC adicionando 100 μL de solução de fibronectina por poço. Deixe revestir sob o capuz por 30 min em RT.
   NOTA: Se o CNCC for destinado à coloração por imunofluorescência, coloque uma lamínula de vidro estéril no fundo do poço antes do revestimento. Certifique-se de que a lâmina fique no fundo do poço e não flutue para evitar revestir o lado oposto ao que será usado. Siga as instruções na seção 5 para fixação e montagem do CNCC.
4. Enquanto isso, na placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC, aspire o máximo possível de meio de diferenciação CNCC dos poços e substitua por 50 μL de accutase. Incubar a 37 °C durante 5 min.
5. Após a incubação, adicione 100 μL de meio de manutenção CNCC por poço para extinguir a accutase. Remova a fibronectina dos poços da placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC receptor. Filtrar o CNCC pós-migratório destacado passando-o através de um filtro de 40 μm no topo do poço da placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC receptor.
   NOTA: Isso filtrará aglomerados de células ou NS restantes que não foram removidos anteriormente. O CNCC cultivado na mesma condição pode ser agrupado em um tubo de 50 mL para ser semeado no mesmo poço de uma placa de 6 poços tratada com TC. Neste caso, cubra o poço com 1 mL de fibronectina e use 1 mL de meio de manutenção CNCC para extinguir a accutase.
6. Deixe o CNCC pós-migratório se conectar por 15-30 min a 37 ° C. Descarte o meio e substitua por 100 μL de meio de manutenção CNCC. Troque o meio a cada 2 dias.
   NOTA: Adicione suavemente o meio, pois o fluxo rápido induz a diferenciação de CNCC em derivados neurais. Se estiver trabalhando em um formato de 6 poços, use 1 mL de meio de manutenção CNCC.

4. Fixação e montagem NS para imunofluorescência

1. No momento desejado, transfira o NS da placa de fundo plano de 96 poços não tratada com TC para um tubo de 2 mL de baixa ligação de DNA cortando a ponta de uma micropipeta p200 e pipete suavemente para cima e para baixo para pegar o NS.
   NOTA: Em momentos posteriores (dia 7 em diante), o SN será grande o suficiente para ser visto a olho nu, mas também será mais difícil de destacar.
2. Deixe o NS repousar no tubo por 3 min em RT, remova o máximo de meio possível e enxágue com 1 mL de PBS frio.
   NOTA: Se transferir NS pequenos de pontos de tempo iniciais (antes dos dias 3-4), gire a 16 × g por 3 min para garantir que o NS se acomode no fundo.
3. Remova o PBS e, em uma capa química, substitua por 2 mL de PFA a 4% em PBS. Incubar por 20 min em RT.
   1. Inverta o tubo lentamente após adicionar a solução de PFA a 4% e deixe-o descansar durante a fixação na lateral. O objetivo é espalhar ligeiramente o NS para que eles não fiquem juntos nesta etapa.
4. Remover a solução de PFA a 4% (na coifa química) e lavar a SN com 1 mL de PBS frio/Tween 0,5%20. Deixe repousar em RT por 3 min. Repita isso 3 vezes no total.
   NOTA: NS se acomodará na parte inferior.
5. Remova PBS / 0,5% Tween20 e adicione 2 mL de PBS / 0,1% Triton X-100. Inverta o tubo e deixe-o descansar de lado. Incubar por 1 h em RT.
6. Lave NS 3 vezes em PBS frio/0,5% Tween20, conforme indicado na etapa 4.4.
7. Remova PBS / 0,5% Tween20 e bloqueie com 2% BSA em PBS a 4 ° C por um mínimo de 1 h, de preferência durante a noite.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas em 2% BSA/PBS por até 1 semana a 4 °C. Proteja da luz.
8. Preparar a solução de anticorpos primários adicionando a diluição correcta do anticorpo primário a 2% de BSA/PBS num volume final de 500 μL. Para a mistura de anticorpos primários usada neste estudo, consulte a Tabela 2.
9. Remova o máximo possível da solução de bloqueio e transfira o NS para um tubo de 0,5 mL cortando a ponta de uma micropipeta p200.
10. Adicione a solução de anticorpo primário e pipete para cima e para baixo lentamente para ressuspender o NS. Incubar durante a noite num rotador a 4 °C.
11. Lave NS 3 vezes em PBS frio por 5 min em RT.
12. Prepare a solução de anticorpos secundários diluindo os anticorpos secundários de escolha em 2% de BSA/PBS e adicionando 1/1000 de DAPI. Para a mistura de anticorpos secundários usada neste estudo, consulte a Tabela 2.
    NOTA: Mantenha os tubos protegidos da luz.
13. Substitua o PBS por 500 μL de solução de anticorpo secundário e envolva o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz. Incubar durante 1 h no rotador à RT.
14. Lave NS 3 vezes em PBS frio, conforme indicado na etapa 4.11.
15. Remova o máximo de PBS possível sem aspirar o NS, substitua por 50 μL de agente de limpeza e siga as instruções do fabricante.
16. Incubar durante a noite em RT, protegido da luz.
17. Prepare as câmaras de montagem.
    1. Em uma lâmina de microscópio, coloque três camadas de fita dupla-face. Use fita transparente e sem fibras para evitar resíduos na câmara de montagem.
    2. Usando uma navalha, corte uma janela de 3 mm × 8 mm na fita dupla.
       NOTA: As dimensões da câmara dependem do ponto de tempo da amostra. Este exemplo é adequado para hospedar 50 μL de meio de montagem, o que é ideal para 10-20 NS únicos em pontos de tempo posteriores (dias 7-9).
18. Sob um estereoscópio, transfira cuidadosamente o NS no agente de limpeza para a câmara de montagem, cortando uma ponta de micropipeta p200 de baixa aderência. Use uma ampliação entre 2x e 4x para fornecer um campo de visão de toda a câmara e ampliação suficiente para identificar o SN. Se o estereoscópio for equipado para imagens fluorescentes, trabalhar com um filtro de fluorescência azul facilitará a identificação do SN, pois a coloração DAPI fará com que o NS transparente se destaque.
    NOTA: Verifique se o meio forma um leve menisco convexo acima da câmara. Isso garantirá que não haja bolhas na câmara.
19. Coloque uma lamínula na superfície e pressione levemente nas laterais para que ela adere. Execute esta etapa sob o estereoscópio e verifique se os NS não são empurrados para fora da câmara.
20. Conservar a 4 °C protegido da luz até à obtenção de imagens.

5. Fixação e montagem CNCC para imunofluorescência

1. Remova o meio de manutenção CNCC dos poços e lave-os com PBS. Adicione PBS suavemente pipetando na lateral do poço.
2. Prossiga com a fixação, permeabilização e coloração conforme descrito nas etapas 4.3-4.14.
3. Monte as lamínulas em uma lâmina de vidro de microscopia adicionando meio de montagem na lâmina, agarrando e girando a lamínula com o uso de uma pinça para que o CNCC pós-migratório fique de frente para a lâmina de vidro e colocando-a na gota.
   1. Opcional: Sele a lamínula com esmalte ou outros sistemas de vedação comumente empregados.
4. Conservar a 4 °C protegido da luz até à obtenção de imagens.

Seguindo o protocolo, as colônias de mESC foram dissociadas e 3000 células foram semeadas em placas de 96 poços não tratadas com TC. No dia 2, os NS agregados foram transferidos para placas de 96 poços de fundo plano não tratadas com TC para permitir que se fixassem. Uma visualização simplificada do protocolo de agregação NS é fornecida na Figura 1A. Os NS foram cultivados até o dia 9 e depois processados para coloração por imunofluorescência....

Modelos de diferenciação 3D in vitro permitem analisar interações celulares complexas que podem ser difíceis - ou não - ser observadas em cultura de células 2D. Vários modelos foram desenvolvidos para estudar o desenvolvimento do CNCC in vitro. Estes são geralmente derivados diretamente de colônias ESC ^7,21 ou explantes de tecido^22,23. Embora e...

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecemos ao Dr. Remi Xavier Coux pelos conselhos sobre o design de primers e experiência em cultura de células. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST) e pela Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).