Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

외배엽 유도체와 중간엽 유도체를 모두 생성할 수 있는 놀라운 능력을 가진 두개골 신경능상세포(CNCC)는 세포의 운명 결정과 가소성을 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 많은 관심을 불러일으켰습니다. 배측 신경 상피에서 유래한 이 세포 집단은 일시적이며 발달 중인 배아에서 상대적으로 드물기 때문에 기능 검사, 게놈 스크리닝 및 생화학 분석을 in vivo에서 수행하기 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 시험관 내에서 CNCC 개발을 모델링하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었습니다.NS(Neurosphere) 기반 배양 방법은 발달 중인 전방 신경 상피를 3D로 요약하는 복잡한 미세환경을 제공합니다. 이러한 시스템을 사용하면 동일한 플레이트에서 많은 NS가 성장하여 많은 양의 CNCC를 생성할 수 있지만, 생성된 NS는 형성된 CNCC의 모양, 크기 및 수에 있어 변동성이 높기 때문에 정량 분석을 수행하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 96웰 형식의 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 NS를 생성하기 위한 재현 가능한 방법을 간략하게 설명합니다. 96웰 플레이트에서 생성된 NS는 두개신경능선세포(CNCC)를 생성하며, 이를 추가로 배양할 수 있습니다. 이 접근법은 시작 세포의 수를 제어함으로써 NS 사이의 크기와 모양의 변동성을 줄이고 실험 전반에 걸쳐 재현성을 높입니다. 마지막으로, 이 배양 시스템은 여러 응용 분야에 적용할 수 있으며 더 높은 수준의 유연성을 제공하여 사용자 정의가 가능하고 다중화 실험 조건에 적합합니다.

두개신경능선세포(Cranial neural crest cells, CNCC)는 발달 중인 배아의 가장 앞쪽, 신경판(neural plate)과 표면 외배엽(surface ectoderm¹) 사이의 경계에서 발생하는 줄기 모양의 세포 집단입니다. 그런 다음 CNCC는 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪고, 신경 상피에서 박리되고, 배아의 다양한 위치로 배측으로 이동하여 다양한 세포 유형으로 분화합니다². 이 세포 집단을 연구하는 것은 놀라운 가소성(plasticity)3과 두개안면뼈⁽craniofacial bones) 및 연골(cartilages)⁴과 같은 외배엽(ectodermal) 및 중간엽(mesenchymal) 유도체로 분화할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있기 때문에 매우 흥미롭습니다. CNCC는 배아에서 비교적 접근하기 쉽지만, 세포 수가 적은 일시적인 집단이기 때문에 in vivo에서 체계적인 기계론적 연구를 수행하기 어렵습니다. CNCC 세포주는 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 몇 년 동안 분리되고 특성화되었습니다. 특히, O9-1 CNCC 세포주는 철새 및 철새 후 신경능선 발달을 연구하기 위한 훌륭한 도구입니다 ^5,6; 그러나 이 세포주는 신경능선 유도 및 사양화로 이어지는 이동 이전의 초기 사건에 대한 연구를 허용하지 않습니다. 이와 관련하여, 배아 줄기 세포(ESC) 집락의 분화 후 얻은 신경구(NS)^7,8)라고 하는 발달 중인 신경 상피와 유사한 3D 구조를 사용하여 접시에서 CNCC를 분화하기 위한 체외 분화 프로토콜의 개발에 상당한 발전이 있었습니다. 이러한 3D 프로토콜은 많은 수의 CNCC를 강력하게 생성하여 생화학 및 게놈 기계론적 연구를 수행할 수 있습니다 ^9,10. NS는 세포 증식을 자극하기 위해 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 표피 성장 인자(EGF)^10,11와 함께 N2B27 보충 배지의 낮은 부착 플레이트에서 배양됩니다. 이러한 프로토콜은 페트리 접시에서 수행되어 동일한 플레이트에서 수많은 NS를 배양합니다. 성장하는 NS 내에서 세포는 응집되고 계속 분열하여 성숙 시 직경이 100-200μm에 이릅니다. 성숙 (약 5 일)에서, NS는 기질에 부착되어 생체 내 대응^{물 9,12}와 유사한 CNCC로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 CNCC는 EMT를 거쳐 플레이트 표면에 박리됩니다. 형태학적 차이는 NS 크기에 따라 관찰될 수 있는데, 영양분과 산소의 가용성이 낮기 때문에 더 큰 구체는 코어에서 더 어둡게 나타나 세포가 세포사멸을 겪게 되기 때문입니다¹³. 이러한 유형의 절차는 분화 종점에서 많은 수의 CNCC를 생성하지만 몇 가지 제한 사항이 있어 분화 과정에서 발생하는 다양한 분자 역학에 대한 연구가 거의 불가능합니다. 첫째, 크기가 다양한 ESC 콜로니를 사용하면 각 실험의 시작 세포 수를 제어하기가 어렵습니다. 그 결과 특정 신호 경로를 활성화하여 다르게 발달하는 다양한 모양과 직경의 NS가 생성되어 세포 분화가 변경되어 주어진 시점에서 균일한 샘플을 형성하지 않습니다. 둘째, 동일한 플레이트에서 여러 NS를 배양하면^{종종 14}개의 NS가 함께 융합되어 이웃의 미세환경과 발달에 영향을 미치는 신호 분자를 방출할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 절차는 샘플과 실험 간에 많은 변동성을 생성합니다.

여기에서는 비 TC 처리된 U-바닥 96웰 플레이트에서 마우스 ESC(mESC)를 응집하여 CNCC를 생성할 수 있는 단일 NS를 생성하는 이러한 어려움을 극복하기 위한 전략을 제시합니다. mESC에서 시작하면 이미 확립된 신경능선 세포주에서 시작하는 것과 비교하여 사양 프로세스와 CNCC 발달의 초기 단계를 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 mESC 콜로니를 분리하는 것으로 시작하며, 이어서 비 TC 처리된 U-바닥 96웰 플레이트의 각 웰에서 특정 수의 mESC를 파종합니다. 세포는 이틀 동안 응집되도록 방치된 후 비 TC 처리된 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 이동하며, 여기서 NS는 플레이트 바닥에 부착할 수 있습니다. 이 프로토콜은 분화 과정에서 각 NS의 시작 세포 수와 미세환경을 제어함으로써 시료 변동성을 줄여 실험 재현성을 높입니다. 우리는 이것이 다양한 배양 조건의 효과를 테스트하거나 유전자 섭동 스크리닝을 수행하는 것과 같은 다중화 실험을 설계하기 위한 편리한 플랫폼이 될 것이라고 믿습니다.

1. 마우스 ESC 군집으로부터 단일 세포 현탁액의 생성

참고: 이 프로토콜은 젤라틴 코팅된 TC 처리된 6웰 플레이트의 비활성화된 공급체에서 성장한 CK35 mESC(생식주 전달에 적합한 mESC 라인, 생체 내 모델¹⁵를 개발할 수 있는 옵션을 갖음)의 사용에 맞게 조정됩니다. TC 처리된 6웰 플레이트의 1웰은 약 1.5 × 10 6mESC를 산출해야 하며, 이는 나머지 프로토콜에 충분합니다. 필요한 경우 확장할 수 있습니다. 선택한 ESC 균주 및 유지 배양 방법과 적절한 배양 배지에 따라 초기 단계를 조정합니다. 이 프로토콜은 멸균 상태에서 수행되어야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. mESC 배양 배지에서 성장한 70%-80% 합류점에서 mESC에서 시작합니다. 본 연구에서 사용된 mESC 배양 배지 조성은 표 1 을 참조하십시오.
   참고: mESC가 80% 이상 합류하지 않도록 하면 분화가 시작되고 집계 프로세스에 영향을 미치므로 mESC가 합류하지 않도록 하십시오. 군체는 조밀해야 하며 건강한 형태(균열이나 파도가 없어야 하며, 뚜렷한 핵-세포질 대비)를 보여야 합니다.
2. CNCC 분화 매체를 준비합니다. CNCC 분화 배지 조성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
   참고: 성장 인자가 추가되면 배지는 4°C에서 최대 3주 동안 보관할 수 있습니다. 매체가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.
3. DMEM-Knockout 배지에서 2mg/mL 농도의 새로운 콜라겐분해효소 용액을 준비합니다.
   참고: 콜라겐분해효소를 사용하면 다음 단계에서 콜로니의 존재가 NS 응집을 방해하기 때문에 피더가 분리되지 않고 콜로니만 분리됩니다. 0.22μm 필터와 함께 사용하기 전에 콜라겐분해효소 용액을 필터링합니다.
4. mESC에서 ESC 배지를 흡인합니다.
5. PBS 1mL를 웰 측면에 부드럽게 첨가합니다. 균일한 세척을 위해 접시를 부드럽게 흔듭니다.
6. PBS를 제거하고 콜라겐 분해 효소 용액 2mL로 대체합니다. 37 ° C에서 30-45 분 동안 배양하십시오.
   1. 처음 20분 후에 10배 배율로 광학 현미경으로 플레이트를 확인하고 그 다음에는 5분마다 플레이트를 확인합니다.
   2. 군체의 가장자리가 말려 보이면 판 쪽을 세게 두드리면 군체가 분리됩니다.
7. 5mL 혈청학 피펫으로 콜로니를 수집하여 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   알림: 광학 현미경으로 플레이트에 남은 군체가 있는지 확인하십시오. 이들은 PBS 세척으로 수집 할 수 있습니다.
8. 콜로니를 16 × g 에서 실온(RT)에서 3분 동안 원심분리합니다.
9. 원뿔형 튜브에서 가능한 한 많은 매체를 흡입하고 튜브 바닥의 집락을 방해하지 않도록 주의하십시오.
10. 0.05% 트립신 용액 1mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 튜브를 배양합니다.
11. 처음에는 p1000으로, 그 다음에는 p200 마이크로피펫으로 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 튜브 내 콜로니를 분리합니다.
    참고: 이것은 단일 세포 현탁액의 관찰을 보장합니다.
12. 트립신을 차단하기 위해 mESC 배양 배지 2mL를 첨가하고 RT에서 3분 동안 160× g 으로 원심분리합니다.상층액을 제거하고 CNCC 분화 배지 1mL를 추가합니다.
13. 자동 세포 계수 장치 또는 현미경으로 표준화된 시스템을 사용하여 제조업체 지침에 따라 세포를 계수합니다.
14. 계수 후 충분한 CNCC 분화 배지로 희석하여 50μL당 3000개의 살아있는 세포 농도를 얻습니다.
15. p200 마이크로피펫을 사용하여 비 TC 처리된 U-bottom 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 50μL를 시딩한 다음 CNCC 분화 배지로 200μL까지 웰을 보충합니다.
    참고: 플레이트를 채우는 동안 균일한 농도를 얻기 위해 p1000 마이크로피펫으로 단일 세포 현탁액을 수시로 재현탁합니다.
16. 37 ° C, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 밤새 배양하십시오.

2. CNCC 감별을 위한 편평하 바닥 96 well 판으로 옮기기

1. 다음 날(1일차)에는 광학 현미경으로 플레이트를 관찰합니다. 명확한 경계가 있는 하나의 작은 세포 클러스터가 각 웰의 바닥에 보이는지 확인합니다. 플레이트를 밤새 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
   참고: 주요 응집체 주위에 일부 세포가 있을 수 있으며 일부는 죽을 수 있습니다. 이것은 NS 집계를 방해하지 않습니다.
2. 2일차에 각 웰에서 100μL의 배지를 천천히 제거합니다.
   1. 매체를 흡입할 때 NS를 제거하지 않도록 주의하십시오. 그렇게 하지 않으려면 피펫 팁을 표면 가까이에, 바닥에서 멀리 놓으십시오.
3. p200 마이크로피펫의 끝을 끝에서 약 3-4mm 떨어진 곳에서 자릅니다. 이를 사용하여 나머지 매체로 NS를 흡인합니다.
   참고: NS를 쉽게 집어 올리려면 흡인하기 전에 위아래로 몇 번 부드럽게 피펫팅합니다.
4. NS와 나머지 배지를 비 TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 광학 현미경으로 전달을 확인한 다음 100μL의 예열된 CNCC 분화 배지로 각각의 새 웰 위에 놓습니다. NS를 37 ° C, 5 % CO₂ 의 인큐베이터에서 4 일째까지 그대로 두십시오.
5. 4일차에 각 웰에서 100μL의 배지를 제거하고 100μL의 예열된 CNCC 분화 배지로 교체합니다.
   알림: 플레이트 바닥의 NS 부착을 방해하지 않으려면 천천히 흡인하고 매체를 교체하십시오.
6. 5일차와 6일차에는 광학 현미경 아래에서 NS 첨부 파일을 확인합니다. NS에서 박리되는 더 가벼운 셀이 NS 본체를 둘러싸기 시작하도록 합니다.
7. 7일차에 2.5에 설명된 대로 매체를 변경합니다. 연구가 종료될 때까지 2일마다 동일한 절차로 배지를 변경합니다.

3. CNCC 패시에이징 및 유지 보수

참고: CNCC passaging은 NS 주변에 충분한 양의 세포가 보이는 즉시 수행할 수 있습니다. 이는 빠르면 7일째가 될 수 있는데, 이는 이전 시점이 충분한 양의 CNCC를 제공하지 않기 때문입니다.

1. CNCC 유지 보수 매체를 준비합니다. CNCC 유지보수 매체 조성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
   1. 매체에 첨가하기 전에 0.22μm 필터를 통해 가용화 후 BSA를 여과합니다. 성장 인자가 추가되면 배지를 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다. 매체가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.
2. PBS에서 7.5μg/mL로 피브로넥틴을 준비합니다. 세게 섞는다.
3. 웰당 100μL의 피브로넥틴 용액을 추가하여 TC가 처리되지 않은 96웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. RT에서 30분 동안 후드 아래에 코팅합니다.
   참고: CNCC가 면역형광 염색을 위한 것이라면 코팅하기 전에 웰 바닥에 멸균 유리 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드가 우물 바닥에 머물고 뜨지 않도록 하여 사용할 슬라이드의 반대쪽이 코팅되지 않도록 하십시오. CNCC 고정 및 장착에 대한 섹션 5의 지침을 따르십시오.
4. 그 동안, non-TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 웰에서 가능한 한 많은 CNCC 분화 매체를 흡입하고 50μL accutase로 대체합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오.
5. 배양 후 웰당 100μL의 CNCC 유지 배지를 추가하여 accutase를 담금질합니다. 수령 non-TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트의 웰에서 피브로넥틴을 제거합니다. 분리된 이동 후 CNCC를 수용 non-TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트의 웰 위에 있는 40μm 필터에 통과시켜 필터링합니다.
   참고: 이렇게 하면 이전에 제거되지 않은 세포 덩어리 또는 남아 있는 NS가 필터링됩니다. 동일한 조건에서 성장한 CNCC를 하나의 50mL 튜브에 모은 다음 TC 처리된 6웰 플레이트의 동일한 웰에 파종할 수 있습니다. 이 경우 웰에 1mL의 피브로넥틴을 코팅하고 1mL의 CNCC 유지 배지를 사용하여 아큐타아제를 담금질합니다.
6. 이동 후 CNCC를 37 °C에서 15-30 분 동안 부착하십시오. 배지를 버리고 100μL의 CNCC 유지보수 배지로 교체하십시오. 2일마다 매체를 변경합니다.
   참고: 빠른 흐름이 CNCC를 신경 유도체로 분화시키므로 배지를 부드럽게 첨가합니다. 6-웰 형식으로 작업하는 경우 1mL의 CNCC 유지보수 매체를 사용하십시오.

4. 면역형광을 위한 NS 정착 그리고 설치

1. 원하는 시점에서, p200 마이크로피펫의 끝을 절단하여 non-TC 처리된 바닥이 평평한 96웰 플레이트에서 DNA 저결합 2mL 튜브로 NS를 옮기고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 NS를 집습니다.
   참고: 나중 시점(7일차 이후)에는 NS가 눈으로 볼 수 있을 만큼 커지지만 분리하기가 더 어려워집니다.
2. RT에서 3분 동안 NS를 튜브에 가라앉히고 가능한 한 많은 매체를 제거한 다음 1mL의 차가운 PBS로 헹굽니다.
   참고: 이른 시점(3-4일 이전)에서 작은 NS를 전송하는 경우 NS가 바닥에 가라앉도록 16× g 에서 3분 동안 회전합니다.
3. PBS를 제거하고 화학 물질 후드에 PBS에 2mL의 4% PFA로 교체합니다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
   1. 4% PFA 용액을 첨가한 후 튜브를 천천히 뒤집고 측면에 고정하는 동안 그대로 두십시오. 목표는 NS를 약간 퍼뜨려 이 단계에서 서로 달라붙지 않도록 하는 것입니다.
4. 4% PFA 용액(화학 물질 후드)을 제거하고 1mL의 차가운 PBS/0.5% Tween20으로 NS를 세척합니다. 3분 동안 RT에 정착시키십시오. 총 3회 반복합니다.
   참고: NS는 맨 아래에 정착합니다.
5. PBS/0.5% Tween20을 제거하고 PBS/0.1% Triton X-100 2mL를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 옆으로 눕힙니다. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 4.4단계에 표시된 대로 차가운 PBS/0.5% Tween20에서 NS를 3회 세척합니다.
7. PBS/0.5% Tween20을 제거하고 4°C의 PBS에서 최소 1시간, 가급적이면 하룻밤 동안 2% BSA로 차단합니다.
   참고: 샘플은 4°C에서 최대 1주일 동안 2% BSA/PBS에 보관할 수 있습니다. 빛으로부터 보호하십시오.
8. 500 μL의 최종 부피에서 2% BSA/PBS에 1차 항체의 올바른 희석을 추가하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 이 연구에 사용된 1차 항체 혼합물은 표 2를 참조하십시오.
9. 차단 용액을 최대한 제거하고 p200 마이크로피펫의 끝을 절단하여 NS를 0.5mL 튜브로 옮깁니다.
10. 1차 항체 용액과 피펫을 천천히 위아래로 첨가하여 NS를 재현탁합니다. 4 °C의 회전기에서 밤새 배양합니다.
11. RT에서 5분 동안 차가운 PBS에서 NS를 3회 세척합니다.
12. 선택한 2차 항체를 2% BSA/PBS로 희석하고 1/1000 DAPI를 첨가하여 2차 항체 용액을 준비합니다. 이 연구에 사용된 2차 항체 혼합물은 표 2를 참조하십시오.
    알림: 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
13. PBS를 500μL의 2차 항체 용액으로 대체하고 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. RT의 회전기에서 1시간 동안 배양합니다.
14. 4.11단계에 표시된 대로 차가운 PBS에서 NS를 3회 세척합니다.
15. NS를 흡인하지 않고 PBS를 최대한 많이 제거하고, 50μL의 투명화제로 대체한 후 제조업체 지침을 따릅니다.
16. 빛으로부터 보호된 RT에서 밤새 배양하십시오.
17. 장착 챔버를 준비합니다.
    1. 현미경 슬라이드에 세 겹의 양면 테이프를 놓습니다. 투명 무섬유 테이프를 사용하여 장착 챔버의 잔류물을 방지하십시오.
    2. 면도기를 사용하여 이중 테이프에서 3mm × 8mm 창을 자릅니다.
       참고: 챔버 치수는 샘플 시점에 따라 다릅니다. 이 예는 50μL의 마운팅 매체를 호스팅하는 데 적합하며, 이는 이후 시점(7-9일)에 10-20개의 단일 NS에 최적입니다.
18. 스테레오스코프 아래에서 저접착력 p200 마이크로피펫 팁을 절단하여 투명화제의 NS를 장착 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 2x에서 4x 사이의 배율을 사용하여 전체 챔버의 시야와 NS를 식별하기에 충분한 배율을 제공합니다. 입체경이 형광 이미징을 위해 장착된 경우 청색 형광 필터로 작업하면 DAPI 염색으로 투명한 NS를 눈에 띄게 만들 수 있으므로 NS를 더 쉽게 식별할 수 있습니다.
    참고: 매체가 챔버 위에 약간 볼록한 반월판을 형성하는지 확인합니다. 이렇게 하면 챔버에 기포가 없는지 확인할 수 있습니다.
19. 표면에 커버슬립을 놓고 측면을 가볍게 눌러 접착되도록 합니다. 스테레오스코프 아래에서 이 단계를 수행하고 NS가 챔버 밖으로 밀려나지 않는지 확인합니다.
20. 이미징 전까지 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관하십시오.

5. 면역형광을 위한 CNCC 정착 그리고 설치

1. 우물에서 CNCC 유지 보수 매체를 제거하고 PBS로 세척합니다. 웰 측면에 피펫팅하여 PBS를 부드럽게 첨가합니다.
2. 4.3-4.14단계에 설명된 대로 고정, 투과화 및 염색을 진행합니다.
3. 슬라이드에 장착 매체를 추가하고, 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 잡고 회전시켜 이동 후 CNCC가 유리 슬라이드를 향하도록하고 드롭에 올려 놓아 현미경 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
   1. 선택 사항: 매니큐어 또는 기타 일반적으로 사용되는 밀봉 시스템으로 커버슬립을 밀봉합니다.
4. 이미징 전까지 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관하십시오.

프로토콜에 따라 mESC 콜로니를 해리하고 3000개의 세포를 비TC 처리된 U-bottom 96웰 플레이트에 파종했습니다. 2일차에 응집된 NS를 비TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮겨 부착할 수 있도록 했습니다. NS 어그리게이션 프로토콜의 단순화된 시각화는 그림 1A에 나와 있습니다. NS는 9일까지 배양한 후 면역형광 염색을 위해 처리했습니다. NS에서 플?...

체외 3D 분화 모델을 사용하면 2D 세포 배양에서 관찰하기 어렵거나 관찰할 수 없는 복잡한 세포 상호 작용을 분석할 수 있습니다. 시험관 내에서 CNCC 발달을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 이들은 일반적으로 배아줄기세포 콜로니(ESC colonies) ^7,21 또는 조직 외식(tissue explant^{) 22,23}

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

프라이머 설계에 대한 조언과 세포 배양에 대한 전문 지식을 제공해 주신 Remi Xavier Coux 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 유럽연구위원회(ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST)와 Fondation pour la Recherche Médicale(Amorçage - AJE202205015403)의 지원을 받았습니다.