Células de la cresta neural craneal Protocolo de diferenciación tridimensional in vitro para ensayos multiplexados

Presentamos un protocolo de diferenciación in vitro tridimensional (3D) que genera neuroesferas de tamaño reproducible para producir células de cresta neural craneal a partir de células madre embrionarias de ratón. Demostramos que esta metodología reduce la variabilidad en comparación con los protocolos anteriores y cómo se puede utilizar para el ensayo multiplexado para estudiar el desarrollo de las células de la cresta neural craneal.

Con su notable capacidad para generar derivados ectodérmicos y mesenquimales, las células de la cresta neural craneal (CNCC) han atraído mucho interés en el estudio de los mecanismos que regulan las decisiones de destino celular y la plasticidad. Originaria del neuroepitelio dorsal, esta población celular es transitoria y relativamente rara en el embrión en desarrollo, lo que dificulta la realización de pruebas funcionales, exámenes genómicos y ensayos bioquímicos in vivo. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado varios métodos para modelar el desarrollo de CNCC in vitro. Los métodos de cultivo basados en la neurosfera (NS) proporcionan un microambiente complejo que recapitula el neuroepitelio anterior en desarrollo en 3D. Estos sistemas permiten el crecimiento de muchos NS en la misma placa para generar una gran cantidad de CNCC, pero los NS producidos presentan una gran variabilidad en la forma, el tamaño y el número de CNCC formados, lo que dificulta la realización de ensayos cuantitativos. Este protocolo describe un método reproducible para generar NS a partir de células madre embrionarias de ratón (mESC) en un formato de 96 pocillos. Las NS generadas en placas de 96 pocillos producen células de cresta neural craneal (CNCC), que se pueden cultivar más adelante. Al controlar el número de células iniciales, este enfoque reduce la variabilidad en el tamaño y la forma entre NS y aumenta la reproducibilidad en todos los experimentos. Por último, este sistema de cultivo es adaptable a varias aplicaciones y ofrece un mayor grado de flexibilidad, lo que lo hace altamente personalizable y adecuado para condiciones experimentales de multiplexación.

Las células de la cresta neural craneal (CNCC) son una población de células madre que surge en la parte más anterior del embrión en desarrollo, en el borde entre la placa neural y el ectodermo de la superficie¹. A continuación, el CNCC se somete a una transición epitelial a mesenquimal (EMT), se deslamina del neuroepitelio y migra dorsoventralmente hacia diversas localizaciones del embrión, donde se diferencian en una amplia variedad de tipos de células². El estudio de esta población celular es de gran interés, ya que posee una notable plasticidad³ y la capacidad única de diferenciarse en derivados ectodérmicos y mesenquimales, como huesos craneofaciales y cartílagos⁴. Aunque los CNCC son relativamente accesibles en el embrión, son una población transitoria con un bajo número de células, lo que dificulta la realización de estudios mecanicistas sistémicos in vivo. En los últimos años se han aislado y caracterizado líneas celulares de CNCC para superar estas limitaciones. En particular, la línea celular O9-1 CNCC es una gran herramienta para estudiar el desarrollo de la cresta neural migratoria y postmigratoria ^5,6; Sin embargo, esta línea celular no permite el estudio de los eventos tempranos antes de la migración que conducen a la inducción y especificación de la cresta neural. En este sentido, ha habido avances significativos en el desarrollo de protocolos de diferenciación in vitro para diferenciar CNCC en una placa mediante el uso de estructuras 3D que se asemejan al neuroepitelio en desarrollo llamadas neuroesferas (NS)^7,8- obtenidas después de la diferenciación de colonias de células madre embrionarias (ESC). Estos protocolos 3D producen de manera robusta un alto número de CNCC, lo que permite la realización de estudios bioquímicos y genómicos mecanicistas ^9,10. Los NS se cultivan en placas de baja fijación en medio suplementado con N2B27, junto con el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF)^10,11 para estimular la proliferación celular. Estos protocolos se llevan a cabo en placas de Petri, cultivando numerosos NS en la misma placa. Dentro del NS en crecimiento, las células se agregan y continúan dividiéndose, alcanzando un diámetro de 100-200 μm en la madurez. En la madurez (alrededor del día 5), las NS se adhieren al sustrato y se diferencian en CNCC que se asemejan a sus contrapartes in vivo ^9,12. A continuación, estos CNCC se someten a EMT y se deslaminan sobre la superficie de la placa. Se pueden observar diferencias morfológicas dependiendo del tamaño del NS, ya que las esferas más grandes aparecerán más oscuras en el núcleo debido a la menor disponibilidad de nutrientes y oxígeno, lo que lleva a las células a sufrir apoptosis¹³. Si bien este tipo de procedimiento genera un gran número de CNCC en el punto final de diferenciación, presenta varias limitaciones, lo que hace que el estudio de las diversas dinámicas moleculares que ocurren durante el proceso de diferenciación sea casi imposible. En primer lugar, el uso de colonias de ESC, que varían en tamaño, dificulta el control del número de células iniciales para cada experimento. Esto da lugar a la generación de SN de varias formas y diámetros que se desarrollan de manera diferente mediante la activación de vías de señalización específicas, lo que conduce a una diferenciación celular alterada y, por lo tanto, a no formar una muestra uniforme en un momento dado. En segundo lugar, el cultivo de múltiples NS en la misma placa a menudo conduce a que se fusionen¹⁴ y potencialmente liberen moléculas de señalización que influyen en el microambiente de sus vecinos y, por lo tanto, en su desarrollo. En conjunto, estos procedimientos generan mucha variabilidad entre muestras y experimentos.

Aquí, presentamos una estrategia para superar estas dificultades que generan NS únicos, capaces de producir CNCC, mediante la agregación de ESC de ratón (mESC) en placas de 96 pocillos con fondo en U no tratadas con TC. Partir de mESC permite estudiar el proceso de especificación y las primeras etapas del desarrollo de CNCC en comparación con partir de líneas celulares de cresta neural ya establecidas. Este protocolo comienza con la desagregación de las colonias de mESC para obtener una suspensión de una sola célula, seguida de la siembra de un número específico de mESC en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U no tratada con TC. Las celdas se dejan agregar durante dos días y posteriormente se trasladan a una placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC, en la que NS podrá adherirse al fondo de la placa. Al controlar el número de células iniciales y el microambiente de cada NS durante el proceso de diferenciación, este protocolo reduce la variabilidad de la muestra, lo que aumenta la reproducibilidad experimental. Creemos que esta será una plataforma conveniente para diseñar experimentos multiplexados, como probar el efecto de diferentes condiciones de cultivo o realizar pantallas de perturbación génica.

1. Generación de una suspensión unicelular a partir de colonias de ESC de ratón

NOTA: Este protocolo está adaptado al uso de CK35 mESC (una línea mESC competente para la transmisión de la línea germinal, para tener luego la opción de desarrollar modelos in vivo ¹⁵) cultivada en alimentadores inactivados en una placa de 6 pocillos tratada con TC recubierta de gelatina. Un pocillo de una placa de 6 pocillos tratada con TC debe producir aproximadamente 1,5 × 10⁶ mESC, lo que es suficiente para el resto del protocolo. Esto se puede ampliar si es necesario. Ajuste los pasos iniciales de acuerdo con la deformación ESC elegida y el método de cultivo de mantenimiento, así como con el medio de cultivo adecuado. Este protocolo debe realizarse en condiciones estériles. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Comience desde mESC en una confluencia del 70%-80% cultivada en un medio de cultivo mESC. Véase la Tabla 1 para la composición del medio de cultivo mESC utilizada en este estudio.
   NOTA: No dejes que las mESC crezcan por encima del 80% de confluencia, ya que comenzarán a diferenciarse, y esto afectará el proceso de agregación. Las colonias deben ser compactas y mostrar una morfología saludable (sin grietas ni ondas, contraste entre el núcleo y el citoplasma distinto).
2. Preparar el medio de diferenciación CNCC. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del medio de diferenciación CNCC.
   NOTA: Una vez añadidos los factores de crecimiento, el medio puede almacenarse hasta 3 semanas a 4 °C. Asegúrese de que el medio esté protegido de la luz.
3. Prepare una solución fresca de colagenasa a una concentración de 2 mg/mL en el medio DMEM-Knockout.
   NOTA: El uso de colagenasa asegura que solo se separen las colonias y no los alimentadores, ya que su presencia en los siguientes pasos interferirá con la agregación de NS. Filtre la solución de colagenasa antes de usar con un filtro de 0,22 μm.
4. Aspire el medio ESC de mESC.
5. Agregue suavemente 1 mL de PBS al costado del pocillo. Agite la placa suavemente para asegurar un lavado uniforme.
6. Retire el PBS y reemplácelo con 2 ml de solución de colagenasa. Incubar a 37 °C durante 30-45 min.
   1. Revise la placa bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x después de los primeros 20 minutos y luego cada 5 minutos.
   2. Cuando las colonias muestren los bordes enrollados, golpee vigorosamente el lado del plato y las colonias se desprenderán.
7. Con una pipeta serológica de 5 mL, recoja las colonias y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mL.
   NOTA: Revise la placa bajo un microscopio óptico para ver si hay colonias sobrantes. Estos se pueden recolectar con un lavado PBS.
8. Centrifugar las colonias a 16 × g durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
9. Aspire la mayor cantidad de medio posible del tubo cónico, teniendo cuidado de no perturbar las colonias en la parte inferior del tubo.
10. Añadir 1 mL de solución de tripsina al 0,05% e incubar el tubo a 37 °C durante 5 min.
11. Disocie las colonias en el tubo pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo, primero con una micropipeta p1000 y luego con una micropipeta p200.
    NOTA: Esto asegura la obtención de una suspensión de una sola celda.
12. Añadir 2 mL de medio de cultivo mESC para bloquear la tripsina y centrifugar a 160 × g durante 3 min en RT. Retirar el sobrenadante y añadir 1 mL de medio de diferenciación CNCC.
13. Cuente las células utilizando un dispositivo de conteo de células automatizado o un sistema estandarizado bajo el microscopio, siguiendo las instrucciones del fabricante.
14. Después del recuento, diluir con suficiente medio de diferenciación CNCC para obtener una concentración de 3000 células vivas por 50 μL.
15. Con una micropipeta p200, siembre 50 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U no tratada con TC y, a continuación, rellene el pocillo hasta 200 μL con medio de diferenciación CNCC.
    NOTA: Mientras llena la placa, vuelva a suspender de vez en cuando la suspensión unicelular con una micropipeta p1000 para obtener una concentración homogénea.
16. Incubar durante la noche en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂.

2. Transferencia a una placa de fondo plano de 96 pocillos para la diferenciación de CNCC

1. Al día siguiente (día 1), observe la placa bajo un microscopio óptico. Asegúrese de que haya un pequeño grupo de celdas con bordes claros visible en el fondo de cada pocillo. Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante la noche.
   NOTA: Puede haber algunas células alrededor del agregado principal, algunas muertas. Esto no interferirá con la agregación de NS.
2. El día 2, retire lentamente 100 μL de medio de cada pocillo.
   1. Al aspirar el medio, tenga cuidado de no quitar el NS. Para evitarlo, coloque la punta de la pipeta cerca de la superficie y lejos del fondo.
3. Corta la punta de una micropipeta p200 a unos 3-4 mm de la punta. Utilícelo para aspirar el NS con el medio restante.
   NOTA: Para facilitar la recogida del SN, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo un par de veces antes de aspirar.
4. Transfiera NS y el medio restante a una placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC y verifique la transferencia bajo un microscopio óptico, luego cubra cada pocillo nuevo con 100 μL de medio de diferenciación CNCC precalentado. Deje NS en la incubadora a 37 °C, 5% de CO_2, hasta el día 4.
5. El día 4, retire 100 μL de medio de cada pocillo y reemplácelo con 100 μL de medio de diferenciación CNCC precalentado.
   NOTA: Para evitar perturbar la fijación NS en la parte inferior de la placa, aspire lentamente y reemplace el medio.
6. En los días 5 y 6, revise el accesorio NS bajo el microscopio óptico. Asegúrese de que las celdas más ligeras, que se deslaminan del NS, comiencen a rodear el cuerpo principal del NS.
7. El día 7, cambie el medio como se describe en 2.5. Cambie el medio con el mismo procedimiento cada 2 días hasta el punto final del estudio.

3. Pasaje y mantenimiento de CNCC

NOTA: El paso de CNCC se puede realizar tan pronto como haya una cantidad suficiente de células visibles alrededor de NS. Esto puede ser ya el día 7, ya que los puntos de tiempo anteriores no proporcionan una cantidad suficiente de CNCC.

1. Preparar el medio de mantenimiento CNCC. Consulte la Tabla 1 para ver la composición del medio de mantenimiento CNCC.
   1. Antes de añadirlo al medio, filtre el BSA después de la solubilización a través de un filtro de 0,22 μm. Una vez añadidos los factores de crecimiento, almacene el medio durante un máximo de 3 semanas a 4 °C. Asegúrese de que el medio esté protegido de la luz.
2. Preparar fibronectina a 7,5 μg/mL en PBS. Mezclar vigorosamente.
3. Cubra los pocillos de una placa de 96 pocillos no tratada con TC agregando 100 μL de solución de fibronectina por pocillo. Deje cubrir debajo del capó durante 30 minutos en RT.
   NOTA: Si los CNCC están diseñados para la tinción con inmunofluorescencia, coloque un cubreobjetos de vidrio estéril en el fondo del pocillo antes de recubrir. Asegúrese de que el portaobjetos permanezca en el fondo del pozo y no flote para evitar cubrir el lado opuesto al que se utilizará. Siga las instrucciones de la sección 5 para la fijación y el montaje del CNCC.
4. Mientras tanto, en la placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC, aspire la mayor cantidad posible de medio de diferenciación de CNCC de los pocillos y sustitúyalo con 50 μL de accutasa. Incubar a 37 °C durante 5 min.
5. Después de la incubación, agregue 100 μL de medio de mantenimiento CNCC por pocillo para apagar la acutasa. Retire la fibronectina de los pocillos de la placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC que la reciba. Filtre los CNCC postmigratorios desprendidos pasándolos a través de un filtro de 40 μm en la parte superior del pocillo de la placa receptora de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC.
   NOTA: Esto filtrará los grupos de células o los NS restantes que no se hayan eliminado previamente. El CNCC cultivado en la misma condición se puede agrupar en un tubo de 50 mL para luego sembrarlo en el mismo pocillo de una placa de 6 pocillos tratada con TC. En este caso, cubra el pocillo con 1 mL de fibronectina y use 1 mL de medio de mantenimiento CNCC para apagar la accutasa.
6. Deje que el CNCC postmigratorio se adhiera durante 15-30 min a 37 °C. Deseche el medio y reemplácelo con 100 μL de medio de mantenimiento CNCC. Cambie el medio cada 2 días.
   NOTA: Agregue suavemente el medio, ya que el flujo rápido induce la diferenciación de CNCC en derivados neuronales. Si trabaja en un formato de 6 pocillos, use 1 mL de medio de mantenimiento CNCC.

4. Fijación y montaje de NS para inmunofluorescencia

1. En el punto de tiempo deseado, transfiera el NS de la placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC a un tubo de 2 ml de ADN de baja unión cortando la punta de una micropipeta p200 y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para recoger el NS.
   NOTA: En puntos de tiempo posteriores (día 7 en adelante), NS será lo suficientemente grande como para ser visto a simple vista, pero también será más difícil de separar.
2. Deje que NS se asiente en el tubo durante 3 min en RT, elimine la mayor cantidad de medio posible y enjuague con 1 mL de PBS frío.
   NOTA: Si transfiere NS pequeños desde puntos de tiempo tempranos (antes de los días 3-4), gire a 16 × g durante 3 minutos para asegurarse de que NS se asiente en el fondo.
3. Retire el PBS y, en una cubierta química, reemplácelo con 2 ml de PFA al 4% en PBS. Incubar durante 20 min en RT.
   1. Invierta el tubo lentamente después de agregar una solución de PFA al 4% y déjelo reposar durante la fijación en el costado. El objetivo es dispersar ligeramente los NS para que no se peguen en este paso.
4. Retire la solución de PFA al 4 % (en la campana química) y lave NS con 1 ml de PBS frío/Tween al 0,5 % 20. Déjalo reposar a RT durante 3 min. Repita esto 3 veces en total.
   NOTA: NS se establecerá en la parte inferior.
5. Retire PBS/0.5% Tween20 y agregue 2 mL de PBS/0.1% Triton X-100. Invierte el tubo y déjalo reposar sobre un lado. Incubar durante 1 h en RT.
6. Lavar NS 3 veces en PBS frío/0.5% Tween20, como se indica en el paso 4.4.
7. Eliminar PBS/0,5% Tween20 y bloquear con 2% de BSA en PBS a 4 °C durante un mínimo de 1 h, preferiblemente durante la noche.
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar en 2% BSA/PBS durante un máximo de 1 semana a 4 °C. Protégete de la luz.
8. Prepare la solución de anticuerpos primarios añadiendo la dilución correcta del anticuerpo primario al 2% de BSA/PBS en un volumen final de 500 μL. Para conocer la mezcla de anticuerpos primarios utilizada en este estudio, consultar la Tabla 2.
9. Retire la mayor cantidad posible de solución de bloqueo y transfiera el NS a un tubo de 0,5 ml cortando la punta de una micropipeta p200.
10. Agregue la solución de anticuerpo primario y pipetee hacia arriba y hacia abajo lentamente para resuspender el SN. Incubar durante la noche en un rotador a 4 °C.
11. Lave NS 3 veces en PBS frío durante 5 min en RT.
12. Prepare la solución de anticuerpos secundarios diluyendo los anticuerpos secundarios de elección en BSA/PBS al 2% y añadiendo 1/1000 DAPI. Para la mezcla de anticuerpos secundarios utilizada en este estudio, ver Tabla 2.
    NOTA: Mantenga los tubos protegidos de la luz.
13. Reemplace el PBS con 500 μL de solución de anticuerpos secundarios y envuelva el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Incubar durante 1 h en el rotador en RT.
14. Lave NS 3 veces en PBS frío, como se indica en el paso 4.11.
15. Retire la mayor cantidad posible de PBS sin aspirar el NS, sustitúyalo por 50 μL de agente limpiador y siga las instrucciones del fabricante.
16. Incubar durante la noche en RT, protegido de la luz.
17. Prepare las cámaras de montaje.
    1. En un portaobjetos de microscopio, coloque tres capas de cinta adhesiva de doble cara. Utilice cinta transparente sin fibras para evitar residuos en la cámara de montaje.
    2. Con una navaja, corte una ventana de 3 mm × 8 mm en la cinta doble.
       NOTA: Las dimensiones de la cámara dependen del punto de tiempo de la muestra. Este ejemplo es adecuado para alojar 50 μL de medio de montaje, que es óptimo para 10-20 NS individuales en puntos de tiempo posteriores (días 7-9).
18. Bajo un estereoscopio, transfiera con cuidado el NS en el agente de limpieza a la cámara de montaje cortando una punta de micropipeta p200 de baja adherencia. Utilice un aumento entre 2x y 4x para proporcionar un campo de visión de toda la cámara y suficiente aumento para identificar el NS. Si el estereoscopio está equipado para imágenes fluorescentes, trabajar con un filtro de fluorescencia azul facilitará la identificación del SN, ya que la tinción DAPI hará que el NS, que de otro modo sería transparente, se destaque.
    NOTA: Verifique que el medio forme un ligero menisco convexo por encima de la cámara. Esto asegurará que no haya burbujas en la cámara.
19. Coloque un cubreobjetos en la superficie y presione ligeramente en sus lados para que se adhiera. Realice este paso bajo el estereoscopio y verifique que los NS no estén empujados fuera de la cámara.
20. Almacenar a 4 °C, protegido de la luz hasta la toma de imágenes.

5. Fijación y montaje de CNCC para inmunofluorescencia

1. Retire el medio de mantenimiento CNCC de los pozos y lávelos con PBS. Agregue PBS suavemente pipeteando en el costado del pocillo.
2. Proceda con la fijación, permeabilización y tinción como se describe en los pasos 4.3-4.14.
3. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio de microscopía agregando medio de montaje en el portaobjetos, agarrando y girando el cubreobjetos con el uso de pinzas para que el CNCC postmigratorio mire hacia el portaobjetos de vidrio y colocándolo en la caída.
   1. Opcional: Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas u otros sistemas de sellado comúnmente empleados.
4. Almacenar a 4 °C, protegido de la luz hasta la toma de imágenes.

Siguiendo el protocolo, se disociaron las colonias de mESC y se sembraron 3000 células en placas de 96 pocillos con fondo en U no tratadas con TC. En el día 2, los NS agregados se transfirieron a placas de 96 pocillos de fondo plano no tratadas con TC para permitir que se adhirieran. En la Figura 1A se proporciona una visualización simplificada del protocolo de agregación NS. Los SN se cultivaron hasta el día 9 y luego se procesaron para la tinción con...

Los modelos de diferenciación 3D in vitro permiten analizar interacciones celulares complejas que podrían ser difíciles -o no- observarse en cultivos celulares 2D. Se han desarrollado varios modelos para estudiar el desarrollo de CNCC in vitro. Por lo general, se derivan directamente de las colonias de ESC ^7,21 o de explantes de tejidos^22,23. Aunque e...

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecemos al Dr. Remi Xavier Coux por sus consejos sobre el diseño de cebadores y su experiencia en el cultivo celular. Este trabajo ha contado con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST) y la Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).