Estabelecendo um modelo de câncer de bexiga superficial murino por meio de uma técnica de administração de células intravesical

Este protocolo descreve um método único para construir um modelo ortotópico de câncer de bexiga superficial.

Este estudo apresenta um método inovador para estabelecer um modelo ortotópico de tumor de bexiga murina com alta eficiência e localização precisa do tumor. Após anestesiar camundongos C57BL / 6J fêmeas em decúbito dorsal, uma agulha intravenosa 24 G é inserida na bexiga para evacuar seu conteúdo. Uma agulha dispensadora de 34 G é então introduzida através do cateter, girada cinco vezes para criar uma lesão focal na mucosa da cúpula da bexiga e, posteriormente, removida. A suspensão de células MB49 é aspirada e conectada a uma agulha dispensadora de 30 G, que é inserida na bexiga através do cateter. As células tumorais são injetadas submucosalmente na bexiga sob pressão. Essa técnica resulta em trauma mínimo para os camundongos, uma alta taxa de captura do tumor e uma localização fixa do tumor. Caracteriza-se pela simplicidade e excelente reprodutibilidade. Este modelo fornece uma plataforma experimental ideal para o desenvolvimento de terapias intravesicais para o câncer de bexiga, facilitando o avanço e a otimização das estratégias de tratamento para essa malignidade.

O câncer de bexiga representa um fardo significativo para a saúde global, com notáveis disparidades específicas de sexo na incidência e no prognóstico. Essa malignidade é caracterizada por subtipos moleculares distintos, cada um associado a diversas vias patogênicas. As características moleculares e patológicas diferem significativamente entre o câncer de bexiga não invasivo do músculo (NMIBC) e o câncer de bexiga invasivo do músculo (MIBC)^1,2. O NMIBC é responsável por aproximadamente 75% dos casos, apresentando tumores de origem epitelial transicional que permanecem localizados sem metástase ou disseminação. Por outro lado, o MIBC é caracterizado pela infiltração de células cancerígenas na camada muscular da bexiga, acompanhada de um alto risco de disseminação, frequentemente necessitando de cistectomia na prática clínica³.

Na pesquisa pré-clínica, modelos que representam com precisão o estágio superficial da doença são essenciais para avaliar as terapias medicamentosas. O estabelecimento de um modelo in situ de carcinoma superficial da bexiga é, portanto, de suma importância, servindo como uma ferramenta de pesquisa crítica para o desenvolvimento de medicamentos clínicos e terapias inovadoras de instilação.

O desenvolvimento de modelos de câncer de bexiga ortotópico murino tradicionalmente enfrenta desafios. Os modelos quimicamente induzidos geralmente começam como tumores superficiais, mas podem evoluir para formas invasivas, com variabilidade que limita sua utilidade em experimentos de grande escala⁴. Os modelos tradicionais de implantação ortotópica, que dependem da injeção de células tumorais através da parede da bexiga⁵, lutam para reproduzir fielmente o câncer superficial da bexiga. Métodos alternativos, incluindo lesão da mucosa combinada com instilação de células tumorais 6,7,8,9,10, foram tentados, mas são limitados por altas taxas de mortalidade e baixas taxas de absorção de tumores, dificultando sua aplicação mais ampla.

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo método para a construção de um modelo de câncer de bexiga superficial que demonstre maior estabilidade, menor mortalidade e posicionamento fixo do tumor em comparação com os modelos existentes. Ao alcançar uma representação mais precisa da doença em seus estágios iniciais, o modelo atual está pronto para aprimorar a avaliação rigorosa das intervenções preventivas e terapêuticas, avançando assim no tratamento do câncer de bexiga.

Todos os protocolos e procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética para Experimentação Animal da Universidade Médica de Tianjin, Tianjin, China (número de aprovação SYXK: 2020-0010). Camundongos C57BL/6J fêmeas de seis a oito semanas de idade foram usados para este estudo. Os animais foram alojados em condições ambientais controladas, incluindo um ciclo claro-escuro de 12 horas, temperaturas variando de 21-25 °C, níveis de umidade ajustáveis entre 30%-70% e acesso irrestrito a comida e água, a menos que especificado de outra forma. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular

1. Cultive a linha celular de câncer de bexiga murina MB49 em meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) para apoiar o crescimento ideal.
2. Manter as culturas de células em condições normais a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO₂. Atualize a mídia a cada 2-3 dias para garantir a saúde e a viabilidade da célula.
3. Colha as células usando um procedimento padronizado de digestão de tripsina. Pipetar suavemente para desalojar as células do frasco de cultura após a aplicação de tripsina e incubação durante um breve período.
4. Conte as células colhidas usando um hemocitômetro para determinar a densidade celular exata. Prepare uma suspensão de célula única ressuspendendo as células a 2 x 10³ / μL em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha esta suspensão no gelo para manter a viabilidade celular.

2. Preparação animal

1. O grupo abriga os camundongos (5 camundongos por gaiola) em gaiolas de policarbonato ventiladas individualmente.
2. Deixe os camundongos se aclimatarem por 7 dias antes do início do estudo.

3. Geração de modelo de tumor ortotópico animal

1. Administre anestesia aos camundongos por injeção intraperitoneal usando uma solução de Avertin a 2,5% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Espere até que os camundongos atinjam um nível adequado de anestesia para a cirurgia, conforme indicado por uma diminuição na frequência respiratória com o aumento da profundidade, ausência de reflexos palpebrais e corneanos, redução do tônus muscular e respostas reflexas e nenhuma reação a um beliscão da cauda.
3. Posicione o mouse anestesiado em decúbito dorsal para facilitar o procedimento.
4. Use um cateter intravenoso 24 G com o estilete agulha removido para o procedimento de cateterismo uretral. Aplique ampla lubrificação no cateter para minimizar o desconforto e facilitar a inserção suave.
5. Identifique a uretra, situada imediatamente posterior às pregas vulvares e anterior à vagina, mantendo o camundongo em decúbito dorsal.
   1. Comece o cateterismo aproximando-se da uretra em um ângulo de 45 graus para navegar abaixo do osso púbico. Ajuste para um ângulo mais raso para guiar o cateter através da uretra e para a bexiga.
6. Evite aplicar força excessiva contra a resistência, pois isso pode levar à perfuração uretral ou da bexiga. Confirme a localização do cateter dentro do lúmen da bexiga verificando se há urina dentro do cateter.
7. Aplique pressão suavemente na parte inferior do abdômen do camundongo para facilitar a drenagem da urina da bexiga. Certifique-se de que a bexiga esteja completamente esvaziada para se preparar para as etapas subsequentes do procedimento.
8. Empurre suavemente o cateter intravenoso 24 G em direção ao topo da bexiga. Certifique-se de que a ponta do cateter entre em contato com o ápice da bexiga.
   1. Assim que o contato for confirmado, solte o cateter, permitindo que ele se retraia ligeiramente. Mantenha o cateter em uma posição fixa em relação ao mouse para garantir a estabilidade e evitar o deslocamento.
9. Insira a agulha dispensadora 34 G modificada ao longo do cateter 24 G. Avance a agulha até atingir o topo da bexiga.
   1. Uma vez posicionada, gire a agulha seis vezes para criar uma lesão localizada na mucosa no ápice da bexiga. Depois de completar a rotação, retire cuidadosamente a agulha ao longo do cateter.
10. Conecte a agulha dispensadora de 30 G ao topo de uma seringa de 1 mL. Garanta uma conexão segura entre a agulha e a seringa.
    1. Uma vez conectado, puxe a suspensão de células MB49 de 2 x 10³/μL pré-preparada para dentro da seringa, puxando suavemente o êmbolo para trás. Verifique se a suspensão celular é aspirada para dentro da seringa sem bolhas de ar.
11. Insira a agulha dispensadora de 30 G ao longo do cateter de 24 G. Certifique-se de que a agulha esteja devidamente alinhada e presa dentro do cateter.
    1. Uma vez posicionado, aplique pressão no êmbolo da seringa de 1 mL para injetar o conteúdo (preparado na etapa 1). Mantenha uma pressão constante no êmbolo por 60 s para garantir que o conteúdo seja fornecido sem redução significativa de volume.
    2. Após 60 s, retire cuidadosamente a seringa e a agulha dispensadora de 30 G do cateter.

4. Acompanhamento pós-operatório

1. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento até que o reflexo de endireitamento retorne.
2. Certifique-se de que o animal não seja deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente.
3. Não devolva o animal à companhia de outros animais até que ele esteja totalmente recuperado.

A eficácia das injeções submucosas foi inicialmente avaliada através da administração de Trypan Blue. Após a injeção, a distribuição do corante na camada submucosa foi claramente visualizada, confirmando a entrega precisa e controlada das substâncias injetadas (Figura 1).

O desenvolvimento do tumor foi meticulosamente rastreado. Aproximadamente 14 dias após o implante, foi observada uma incidência notável de hematú...

A pesquisa sobre câncer de bexiga depende de modelos animais, que são indispensáveis tanto para a pesquisa básica quanto para a aplicada. Para melhor mimetizar o ambiente de crescimento tumoral, os modelos ortotópicos de tumor de bexiga fornecem uma abordagem superior em comparação com os modelos de tumor subcutâneo¹¹.

Atualmente, os modelos ortotópicos de câncer de bexiga podem ser categorizados com base em propósitos experi...

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Este estudo foi apoiado pelo fundo do Projeto Chave da Indústria de Saúde Municipal de Tianjin (concessão nº. TJWJ2022XK014), o fundo do Projeto de Pesquisa Científica da Comissão Municipal de Educação de Tianjin (concessão nº 2022ZD069), o Programa de Financiamento de Talentos do Instituto de Urologia de Tianjin (concessão nº. MYSRC202310), o fundo do Projeto de Pesquisa em Medicina Clínica do Segundo Hospital da Universidade Médica de Tianjin (concessão nº 2023LC03), o Fundo Juvenil do Segundo Hospital da Universidade Médica de Tianjin (concessão nº 2022ydey15) e o Projeto de Cultivo de Talentos do Departamento de Urologia, o Segundo Hospital da Universidade Médica de Tianjin (concessão nº. MNRC202313). Os patrocinadores desempenharam um papel na preparação, revisão e aprovação do manuscrito.