Definizione di un modello murino di carcinoma superficiale della vescica tramite una tecnica di somministrazione di cellule intravescicali

Questo protocollo descrive un metodo unico per la costruzione di un modello ortotopico di carcinoma superficiale della vescica.

Questo studio presenta un metodo innovativo per stabilire un modello ortotopico di tumore della vescica murina con alta efficienza e precisa localizzazione del tumore. Dopo aver anestetizzato topi femmina C57BL/6J in posizione supina, un ago endovenoso da 24 G viene inserito nella vescica per evacuarne il contenuto. Un ago da 34 G viene quindi introdotto attraverso il catetere, ruotato cinque volte per creare una lesione focale alla mucosa della cupola vescicale e successivamente rimosso. La sospensione cellulare MB49 viene aspirata e collegata a un ago di erogazione da 30 G, che viene inserito nella vescica tramite il catetere. Le cellule tumorali vengono iniettate per via sottomucosa nella vescica sotto pressione. Questa tecnica si traduce in un trauma minimo per i topi, un alto tasso di assunzione del tumore e una posizione fissa del tumore. È caratterizzato da semplicità e ottima riproducibilità. Questo modello fornisce una piattaforma sperimentale ideale per lo sviluppo di terapie intravescicali per il cancro della vescica, facilitando l'avanzamento e l'ottimizzazione delle strategie di trattamento per questo tumore maligno.

Il cancro della vescica rappresenta un significativo onere sanitario globale, con notevoli disparità specifiche per sesso in termini di incidenza e prognosi. Questa neoplasia è caratterizzata da sottotipi molecolari distinti, ciascuno associato a diverse vie patogene. Le caratteristiche molecolari e patologiche differiscono significativamente tra il carcinoma della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC) e il carcinoma della vescica muscolo-invasivo (MIBC)^1,2. La NMIBC rappresenta circa il 75% dei casi, con tumori di origine epiteliale transitoria che rimangono localizzati senza metastasi o diffusione. Al contrario, la MIBC è caratterizzata dall'infiltrazione di cellule tumorali nello strato muscolare della vescica, accompagnata da un alto rischio di disseminazione, che spesso richiede la cistectomia nella pratica clinica³.

Nella ricerca preclinica, i modelli che rappresentano accuratamente lo stadio superficiale della malattia sono essenziali per valutare le terapie farmacologiche. La creazione di un modello in situ di carcinoma superficiale della vescica è, quindi, di fondamentale importanza, in quanto funge da strumento di ricerca critico per lo sviluppo di farmaci clinici e terapie instillative innovative.

Lo sviluppo di modelli murini di carcinoma ortotopico della vescica ha tradizionalmente affrontato delle sfide. I modelli indotti chimicamente spesso iniziano come tumori superficiali, ma possono evolvere in forme invasive, con una variabilità che ne limita l'utilità negli esperimenti su larga scala⁴. I modelli tradizionali di impianto ortotopico, che si basano sull'iniezione di cellule tumorali attraverso la parete della vescica⁵, faticano a riprodurre fedelmente il cancro superficiale della vescica. Sono stati tentati metodi alternativi, tra cui il danno della mucosa combinato con l'instillazione di cellule tumorali 6,7,8,9,10, ma sono limitati da alti tassi di mortalità e bassi tassi di assunzione del tumore, ostacolando la loro più ampia applicazione.

Questo studio mira a sviluppare un nuovo metodo per la costruzione di un modello di cancro superficiale della vescica che dimostri una maggiore stabilità, una minore mortalità e un posizionamento fisso del tumore rispetto ai modelli esistenti. Ottenendo una rappresentazione più precisa della malattia nelle sue fasi iniziali, l'attuale modello è pronto a migliorare la valutazione rigorosa degli interventi preventivi e terapeutici, facendo così progredire il trattamento del cancro della vescica.

Tutti i protocolli e le procedure sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato di revisione etica per la sperimentazione animale della Tianjin Medical University, Tianjin, Cina (numero di approvazione SYXK: 2020-0010). Per questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di sei-otto settimane. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni ambientali controllate, tra cui un ciclo luce-buio di 12 ore, temperature comprese tra 21 e 25 °C, livelli di umidità regolabili tra il 30% e il 70% e accesso illimitato a cibo e acqua, se non diversamente specificato. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle cellule

1. Coltura della linea cellulare di carcinoma della vescica murina MB49 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completo, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per supportare una crescita ottimale.
2. Mantenere le colture cellulari in condizioni standard a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5%. Aggiorna i terreni ogni 2-3 giorni per garantire la salute e la vitalità delle cellule.
3. Raccogli le cellule utilizzando una procedura standardizzata di digestione della tripsina. Pipettare delicatamente per rimuovere le cellule dal pallone di coltura dopo aver applicato la tripsina e aver incubato per un breve periodo.
4. Conta le cellule raccolte utilizzando un emocitometro per determinare l'esatta densità cellulare. Preparare una sospensione a cellula singola risospendendo le cellule a 2 x 10³/μL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mantenere questa sospensione sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.

2. Preparazione degli animali

1. Il gruppo ospita i topi (5 topi per gabbia) in gabbie di policarbonato ventilate individualmente.
2. Lasciare che i topi si acclimatino per 7 giorni prima dell'inizio dello studio.

3. Generazione di modelli di tumore ortotopico animale

1. Somministrare l'anestesia ai topi tramite iniezione intraperitoneale utilizzando una soluzione al 2,5% di Avertin (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
2. Attendere che i topi raggiungano un livello appropriato di anestesia per l'intervento chirurgico, come indicato da una diminuzione della frequenza respiratoria con un aumento della profondità, l'assenza di riflessi palpebrali e corneali, riduzione del tono muscolare e delle risposte riflesse e nessuna reazione a un pizzico della coda.
3. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina per facilitare la procedura.
4. Utilizzare un catetere endovenoso da 24 G con lo stiletto dell'ago rimosso per la procedura di cateterismo uretrale. Applicare un'ampia lubrificazione al catetere per ridurre al minimo il disagio e facilitare l'inserimento senza problemi.
5. Identificare l'uretra, situata immediatamente posteriormente alle pieghe vulvari e anteriormente alla vagina, mantenendo il topo in posizione supina.
   1. Inizia il cateterismo avvicinandoti all'uretra con un angolo di 45 gradi per navigare sotto l'osso pubico. Regolare su un angolo più basso per guidare il catetere attraverso l'uretra e nella vescica.
6. Evitare di applicare una forza eccessiva contro la resistenza, in quanto ciò può portare alla perforazione uretrale o della vescica. Confermare la posizione del catetere all'interno del lume della vescica controllando la presenza di urina all'interno del catetere.
7. Applicare delicatamente una pressione sul basso addome del topo per facilitare il drenaggio dell'urina dalla vescica. Assicurarsi che la vescica sia completamente svuotata per prepararsi alle fasi successive della procedura.
8. Spingere delicatamente il catetere endovenoso da 24 G verso la parte superiore della vescica. Assicurarsi che la punta del catetere sia a contatto con l'apice della vescica.
   1. Una volta confermato il contatto, rilasciare il catetere, lasciandolo ritrarre leggermente. Mantenere il catetere in una posizione fissa rispetto al topo per garantire stabilità e prevenire lo spostamento.
9. Inserire l'ago di erogazione da 34 G modificato lungo il catetere da 24 G. Far avanzare l'ago fino a raggiungere la parte superiore della vescica.
   1. Una volta posizionato, ruotare l'ago sei volte per creare una lesione localizzata della mucosa all'apice della vescica. Dopo aver completato la rotazione, estrarre con cautela l'ago lungo il catetere.
10. Collegare l'ago da 30 G alla parte superiore di una siringa da 1 ml. Assicurarsi che il collegamento tra l'ago e la siringa sia sicuro.
    1. Una volta collegata, aspirare la sospensione cellulare MB49 da 2 x 10³/μL pre-preparata nella siringa tirando delicatamente indietro lo stantuffo. Verificare che la sospensione cellulare sia aspirata nella siringa senza bolle d'aria.
11. Inserire l'ago di erogazione da 30 G lungo il catetere da 24 G. Assicurarsi che l'ago sia correttamente allineato e fissato all'interno del catetere.
    1. Una volta posizionata, esercitare pressione sullo stantuffo della siringa da 1 ml per iniettare il contenuto (preparato al punto 1). Mantenere una pressione costante sullo stantuffo per 60 s per garantire che il contenuto venga erogato senza una significativa riduzione del volume.
    2. Dopo 60 s, estrarre con cautela la siringa e l'ago da 30 G dal catetere.

4. Monitoraggio post-operatorio

1. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina su un termoforo fino al ritorno del riflesso di raddrizzamento.
2. Assicurarsi che l'animale non venga lasciato incustodito fino a quando non ha ripreso sufficiente conoscenza.
3. Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.

L'efficacia delle iniezioni sottomucose è stata inizialmente valutata attraverso la somministrazione di Trypan Blue. Dopo l'iniezione, la distribuzione del colorante all'interno dello strato sottomucoso è stata chiaramente visualizzata, confermando la somministrazione precisa e controllata delle sostanze iniettate (Figura 1).

Lo sviluppo del tumore è stato meticolosamente monitorato. Circa 14 giorni dopo l'impianto, è stata os...

La ricerca sul cancro della vescica si basa su modelli animali, indispensabili sia per la ricerca di base che per quella applicata. Per imitare meglio l'ambiente di crescita del tumore, i modelli di tumore ortotopico della vescica forniscono un approccio superiore rispetto ai modelli di tumore sottocutaneo¹¹.

Attualmente, i modelli di carcinoma ortotopico della vescica possono essere classificati in base a scopi sperimentali in due tipi...

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo studio è stato sostenuto dal fondo Tianjin Municipal Health Industry Key Project (sovvenzione n. TJWJ2022XK014), il fondo per il progetto di ricerca scientifica della Commissione municipale per l'istruzione di Tianjin (sovvenzione n. 2022ZD069), il programma di finanziamento dei talenti dell'Istituto di urologia di Tianjin (sovvenzione n. MYSRC202310), il fondo per il progetto di ricerca in medicina clinica del secondo ospedale dell'Università di medicina di Tianjin (sovvenzione n. 2023LC03), il Fondo per i giovani del secondo ospedale dell'Università di medicina di Tianjin (sovvenzione n. 2022ydey15) e il progetto di coltivazione dei talenti del Dipartimento di Urologia, del Secondo Ospedale dell'Università di Medicina di Tianjin (sovvenzione n. MNRC202313). Gli sponsor hanno avuto un ruolo nella preparazione, nella revisione e nell'approvazione del manoscritto.