ביסוס מודל שטחי של סרטן שלפוחית השתן בעכברים באמצעות טכניקת ניהול תאים תוך-שלפוחית

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לבניית מודל אורתוטופי של סרטן שלפוחית השתן השטחי.

מחקר זה מציג שיטה חדשנית לביסוס מודל גידול אורתוטופי של שלפוחית השתן בעכברים עם יעילות גבוהה ומיקום מדויק של הגידול. לאחר הרדמת עכברי C57BL/6J נקבות במצב שכיבה, מוחדרת מחט תוך ורידית 24 גרם לשלפוחית השתן כדי לפנות את תכולתה. לאחר מכן מוחדרת מחט 34 G דרך הצנתר, מסובבת חמש פעמים כדי ליצור פגיעה מוקדית ברירית כיפת שלפוחית השתן, ולאחר מכן מוסרת. תרחיף התאים MB49 נשאב ומחובר למחט חלוקה של 30 G, המוחדרת לשלפוחית השתן דרך הצנתר. תאי גידול מוזרקים תת-רירית לשלפוחית השתן בלחץ. טכניקה זו מביאה לטראומה מינימלית לעכברים, קצב נטילת גידול גבוה ומיקום גידול קבוע. הוא מאופיין בפשטות וביכולת שחזור מעולה. מודל זה מספק פלטפורמה ניסויית אידיאלית לפיתוח טיפולים תוך-שלפוחיתיים לסרטן שלפוחית השתן, מה שמקל על קידום ואופטימיזציה של אסטרטגיות טיפול בגידול ממאיר זה.

סרטן שלפוחית השתן מייצג נטל בריאותי עולמי משמעותי, עם הבדלים בולטים ספציפיים למין בשכיחות ובפרוגנוזה. ממאירות זו מאופיינת בתת-סוגים מולקולריים מובחנים, שכל אחד מהם קשור למסלולים פתוגניים מגוונים. המאפיינים המולקולריים והפתולוגיים שונים באופן משמעותי בין סרטן שלפוחית השתן שאינו פולשני לשריר (NMIBC) לבין סרטן שלפוחית השתן פולשני לשרירים (MIBC)^1,2. NMIBC מהווה כ-75% מהמקרים, וכולל גידולים ממקור אפיתל מעבר שנשארים מקומיים ללא גרורות או התפשטות. לעומת זאת, MIBC מאופיין בחדירת תאים סרטניים לשכבת השריר של שלפוחית השתן, המלווה בסיכון גבוה להתפשטות, המחייב לעתים קרובות כריתת ציסטה בפרקטיקה הקלינית³.

במחקר פרה-קליני, מודלים המייצגים במדויק את השלב השטחי של המחלה חיוניים להערכת טיפולים תרופתיים. הקמת מודל שטחי של קרצינומה של שלפוחית השתן באתרה היא, אם כן, בעלת חשיבות עליונה, המשמשת כלי מחקרי קריטי לפיתוח תרופות קליניות וטיפולי החדרה חדשניים.

הפיתוח של מודלים של סרטן שלפוחית השתן בעכברים התמודד באופן מסורתי עם אתגרים. מודלים המושרים כימית מתחילים לעתים קרובות כגידולים שטחיים אך עשויים להתפתח לצורות פולשניות, עם שונות המגבילה את התועלת שלהם בניסויים בקנה מידה גדול⁴. מודלים מסורתיים של השתלה אורתוטופית, המסתמכים על הזרקת תאי גידול דרך דופן שלפוחית השתן⁵, מתקשים לשחזר נאמנה סרטן שלפוחית השתן השטחי. שיטות חלופיות, כולל פגיעה ברירית בשילוב עם החדרת תאי גידול 6,7,8,9,10, נוסו אך מוגבלות על ידי שיעורי תמותה גבוהים ושיעורי לקיחת גידול נמוכים, מה שמעכב את יישומן הרחב יותר.

מחקר זה נועד לפתח שיטה חדשה לבניית מודל שטחי של סרטן שלפוחית השתן המדגים יציבות רבה יותר, תמותה נמוכה יותר ומיקום קבוע של הגידול בהשוואה למודלים הקיימים. על ידי השגת ייצוג מדויק יותר של המחלה בשלביה המוקדמים, המודל הנוכחי עומד לשפר את ההערכה הקפדנית של התערבויות מניעתיות וטיפוליות, ובכך לקדם את הטיפול בסרטן שלפוחית השתן.

כל הפרוטוקולים והנהלים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הביקורת האתית לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית טיאנג'ין, טיאנג'ין, סין (מספר אישור SYXK: 2020-0010). עכברי C57BL/6J נקבות בנות שישה עד שמונה שבועות שימשו למחקר זה. בעלי החיים שוכנו בתנאים סביבתיים מבוקרים, כולל מחזור אור-חושך של 12 שעות, טמפרטורות שנעו בין 21-25 מעלות צלזיוס, רמות לחות מתכווננות בין 30%-70%, וגישה בלתי מוגבלת למזון ומים, אלא אם צוין אחרת. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

1. תרבית את קו התאים של סרטן שלפוחית השתן של העכברים MB49 במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) לתמיכה בצמיחה מיטבית.
2. שמור על תרביות התאים בתנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO₂. רענן את המדיה כל 2-3 ימים כדי להבטיח את בריאות התאים וחיותם.
3. קצרו את התאים באמצעות הליך עיכול טריפסין סטנדרטי. פיפטה בעדינות כדי לעקור את התאים מבקבוק התרבית לאחר מריחת טריפסין ודגירה לתקופה קצרה.
4. ספרו את התאים שנקטפו באמצעות המוציטומטר כדי לקבוע את צפיפות התאים המדויקת. הכן תרחיף של תא יחיד על ידי השעיית תאים ל-2 x 10³/μL בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). שמור את התרחיף הזה על קרח כדי לשמור על כדאיות התא.

2. הכנת בעלי חיים

1. קבוצה מאכלסת את העכברים (5 עכברים בכלוב) בכלובי פוליקרבונט מאווררים בנפרד.
2. אפשרו לעכברים להתאקלם במשך 7 ימים לפני תחילת המחקר.

3. יצירת מודל גידול אורתוטופי של בעלי חיים

1. מתן הרדמה לעכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית באמצעות תמיסה של 2.5% של אברטין (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
2. יש להמתין עד שהעכברים יגיעו לרמת הרדמה מתאימה לניתוח, כפי שמעידים ירידה בקצב הנשימה עם עלייה בעומק, היעדר רפלקסים בעפעפיים ובקרנית, ירידה בטונוס השרירים ובתגובות רפלקס וללא תגובה לצביטה בזנב.
3. מקם את העכבר המורדם במצב שכיבה כדי להקל על ההליך.
4. השתמש בצנתר תוך-ורידי 24 גרם כאשר המחט הוסרה לצורך הליך צנתור השופכה. מרחו סיכה בשפע על הצנתר כדי למזער את אי הנוחות ולהקל על החדרה חלקה.
5. זהה את השופכה, הממוקמת מיד מאחורי קפלי הפות וקדמית לנרתיק, תוך שמירה על העכבר במצב שכיבה.
   1. התחל את הצנתור על ידי התקרבות לשופכה בזווית של 45 מעלות כדי לנווט מתחת לעצם הערווה. התאם לזווית רדודה יותר כדי להנחות את הקטטר דרך השופכה לתוך שלפוחית השתן.
6. הימנע מהפעלת כוח מופרז כנגד התנגדות, מכיוון שהדבר עלול להוביל לניקוב בשופכה או בשלפוחית השתן. אשר את מיקום הצנתר בתוך לומן שלפוחית השתן על ידי בדיקת שתן בתוך הצנתר.
7. הפעל בעדינות לחץ על הבטן התחתונה של העכבר כדי להקל על ניקוז השתן משלפוחית השתן. ודא ששלפוחית השתן מרוקנת לחלוטין כדי להתכונן לשלבים הבאים של ההליך.
8. דחף בעדינות את הצנתר התוך-ורידי 24G לכיוון החלק העליון של שלפוחית השתן. ודא שקצה הקטטר יוצר מגע עם קודקוד שלפוחית השתן.
   1. לאחר אישור המגע, שחרר את הקטטר ואפשר לו לסגת מעט. שמור את הצנתר במצב קבוע ביחס לעכבר כדי להבטיח יציבות ולמנוע תזוזה.
9. הכנס את מחט החלוקה של 34 G שהשתנתה לאורך צנתר 24 G. מקדמים את המחט עד שהיא מגיעה לחלק העליון של שלפוחית השתן.
   1. לאחר המיקום, סובב את המחט שש פעמים כדי ליצור פגיעה רירית מקומית בקודקוד שלפוחית השתן. לאחר השלמת הסיבוב, משוך בזהירות את המחט לאורך הצנתר.
10. חבר את מחט החלוקה של 30 גרם לחלק העליון של מזרק של 1 מ"ל. ודא חיבור מאובטח בין המחט למזרק.
    1. לאחר החיבור, משוך את מתלה התאים 2 x 10³/μL MB49 שהוכן מראש לתוך המזרק על ידי משיכה עדינה לאחור של הבוכנה. ודא כי מתלה התא נשאב לתוך המזרק ללא בועות אוויר.
11. הכנס את מחט החלוקה של 30 G לאורך הצנתר 24 G. ודא שהמחט מיושרת ומאובטחת כהלכה בתוך הצנתר.
    1. לאחר המיקום, הפעל לחץ על הבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי להזריק את התכולה (הוכן בשלב 1). שמור על לחץ קבוע על הבוכנה למשך 60 שניות כדי להבטיח שהתוכן מועבר ללא הפחתת נפח משמעותית.
    2. לאחר 60 שניות, משוך בזהירות את המזרק ואת מחט החלוקה של 30 G מהקטטר.

4. ניטור לאחר הניתוח

1. הנח את העכבר המורדם במצב שכיבה על כרית חימום עד שרפלקס היישור יחזור.
2. ודא שהחיה לא נשארת ללא השגחה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת.
3. אין להחזיר את בעל החיים לחברת בעלי חיים אחרים עד שהוא מתאושש לחלוטין.

היעילות של זריקות תת-ריריות הוערכה בתחילה באמצעות מתן טריפן בלו. לאחר ההזרקה, פיזור הצבע בתוך השכבה התת-רירית הוצג בבירור, מה שאישר את המסירה המדויקת והמבוקרת של החומרים המוזרקים (איור 1).

התפתחות הגידול הייתה במעקב קפדני. כ-14 יום לאחר ההשתל?...

המחקר על סרטן שלפוחית השתן מסתמך על מודלים של בעלי חיים, שהם הכרחיים למחקר בסיסי ויישומי כאחד. כדי לחקות טוב יותר את סביבת גידול הגידול, מודלים אורתוטופיים של גידול שלפוחית השתן מספקים גישה מעולה בהשוואה למודלים של גידול תת עורי¹¹.

נכון לעכשיו,...

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

מחקר זה נתמך על ידי קרן פרויקט מפתח תעשיית הבריאות העירונית של טיאנג'ין (מענק מס. TJWJ2022XK014), קרן פרויקט המחקר המדעי של ועדת החינוך העירונית של טיאנג'ין (מענק מס' 2022ZD069), תוכנית מימון הכישרונות של מכון טיאנג'ין לאורולוגיה (מענק מס'. MYSRC202310), קרן פרויקט המחקר לרפואה קלינית של בית החולים השני של האוניברסיטה הרפואית טיאנג'ין (מענק מס' 2023LC03), קרן הנוער של בית החולים השני של האוניברסיטה הרפואית טיאנג'ין (מענק מס' 2022ydey15), ופרויקט טיפוח הכישרונות של המחלקה לאורולוגיה, בית החולים השני של האוניברסיטה הרפואית טיאנג'ין (מענק מס. MNRC202313). נותני החסות מילאו תפקיד בהכנה, סקירה ואישור של כתב היד.