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Resumo

Este estudo investigou as relações entre doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e infarto do miocárdio (IM) por meio de genes co-expressos, identificando a Trombospondina 1 (THBS1) como biomarcador. A análise de imunoinfiltração revelou células T CD8+ e neutrófilos como fatores-chave, com THBS1 mostrando potencial como ferramenta diagnóstica para DHGNA e IM.

Resumo

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e o infarto do miocárdio (IM) são dois grandes problemas de saúde com prevalência e mortalidade significativas. Este estudo teve como objetivo explorar os genes co-expressos para entender a relação entre NAFLD e IM e identificar potenciais biomarcadores cruciais de IM relacionados à NAFLD usando bioinformática e aprendizado de máquina. A análise de enriquecimento funcional foi conduzida, um diagrama de rede de interação co-proteína-proteína (PPI) foi construído e as técnicas de eliminação de características recursivas de máquina de vetor de suporte (SVM-RFE) e operador de seleção e encolhimento absoluto mínimo (LASSO) foram empregadas para identificar um gene diferencialmente expresso (DEG), Trombospondina 1 (THBS1). O THBS1 demonstrou forte desempenho na distinção entre pacientes com DHGNA (AUC = 0,981) e pacientes com IM (AUC = 0,900). A análise de imunoinfiltração revelou células T CD8+ significativamente mais baixas e níveis mais altos de neutrófilos em pacientes com DHGNA e IM. As células T CD8+ e os neutrófilos foram eficazes na distinção entre DHGNA/IM e controles saudáveis. A análise de correlação mostrou que o THBS1 foi positivamente correlacionado com CCR (receptor de quimiocina), classe MHC (classe do complexo principal de histocompatibilidade), neutrófilos, parainflamação e Tfh (células T auxiliares foliculares) e negativamente correlacionado com células T CD8+, atividade citolítica e TIL (linfócitos infiltrantes de tumor) em pacientes com DHGNA e IM. O THBS1 surgiu como um novo biomarcador para o diagnóstico de DHGNA/IM em comparação com controles saudáveis. Os resultados indicam que as células T CD8+ e os neutrófilos podem servir como características imunes inflamatórias para diferenciar pacientes com DHGNA/IM de indivíduos saudáveis.

Introdução

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é um importante problema de saúde pública, com uma prevalência de 25% a 30%1. Foi relatado que a prevalência de DHGNA é alta entre pacientes com diabetes2. No entanto, o significado da DHGNA em pacientes não diabéticos ainda não está claro. Estudos têm sugerido que a DHGNA desempenha um papel independente na patogênese da aterosclerose 3,4. Além disso, uma metanálise mostrou que a DHGNA está intimamente associada à calcificação da artéria coronária, disfunção endotelial e aterosclerose, e emergiu como um fator de risco cardiovascular independente5. A conexão entre DHGNA e doença cardiovascular ainda requer mais investigação.

O infarto do miocárdio (IM) é uma doença catastrófica que ameaça a saúde e impõe um ônus econômico significativo aos pacientes e suas famílias em todo o mundo6. O infarto do miocárdio também é uma das principais causas de morte em pacientes com DHGNA. Um estudo clínico publicado no British Medical Journal mostrou que o risco de infarto do miocárdio em pacientes com DHGNA é 1,17 vezes maior do que em pacientes sem DHGNA 7,8. Alguns estudos identificaram vias moleculares, incluindo inflamação, estresse oxidativo e metabolismo lipídico, que contribuem para o IM relacionado à DHGNA 9,10,11. No entanto, os mecanismos subjacentes que ligam a DHGNA e o IM permanecem obscuros. É crucial identificar novos biomarcadores relacionados ao prognóstico da DHGNA e do IM.

O aumento da prevalência de DHGNA, que afeta um amplo segmento da população, ressalta um importante problema de saúde pública, principalmente devido à sua associação com o diabetes. No entanto, o impacto da DHGNA em pacientes não diabéticos permanece pouco compreendido. A DHGNA tem sido implicada na patogênese da aterosclerose e é reconhecida como um fator de risco cardiovascular independente, estando intimamente ligada à calcificação da artéria coronária, disfunção endotelial e aterosclerose. Apesar dessas associações, os mecanismos precisos que unem a DHGNA e doenças cardiovasculares, como o infarto do miocárdio (IM), requerem maior elucidação. O IM é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo e impõe um fardo econômico significativo. O risco de infarto do miocárdio em pacientes com DHGNA é notavelmente maior do que naqueles sem DHGNA, destacando a necessidade de uma compreensão mais profunda das vias moleculares que conectam essas condições. Embora a inflamação, o estresse oxidativo e o metabolismo lipídico tenham sido sugeridos como fatores contribuintes, os mecanismos exatos permanecem obscuros. Há uma necessidade urgente de identificar novos biomarcadores que possam fornecer informações sobre o prognóstico e o tratamento do infarto do miocárdio relacionado à DHGNA.

Consequentemente, neste estudo, conjuntos de dados de microarray de RNA para NAFLD e MI foram baixados do National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, consulte a Tabela de Materiais) para identificar e analisar a interação de genes diferencialmente expressos (DEGs) entre NAFLD e MI. Análise de enriquecimento, construção de diagrama de rede de interação proteína-proteína (PPI), eliminação de características recursivas de máquina de vetor de suporte (SVM-RFE), e algoritmos de operador de encolhimento e seleção de mínimo absoluto (LASSO) foram usados para identificar genes hub 12,13,14,15,16,17,18,19. A análise de imunoinfiltração foi realizada para examinar células imunes em pacientes com DHGNA e IM. Em última análise, esses métodos foram integrados para elucidar a relação entre DHGNA e IM. A Figura 1 ilustra a sequência de desenho seguida neste estudo. Ao combinar bioinformática, aprendizado de máquina e análise de imunoinfiltração, este estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma nova plataforma de suporte à decisão médica.

As principais contribuições deste artigo são: (1) Identificação de genes co-expressos: O estudo destaca a relação entre NAFLD e IM identificando genes co-expressos, oferecendo uma compreensão mais profunda das ligações moleculares entre essas duas condições. (2) Aplicação de bioinformática e aprendizado de máquina: Usando técnicas de bioinformática e aprendizado de máquina, incluindo eliminação de recursos recursivos de máquina de vetor de suporte (SVM-RFE)17 e operador de seleção e encolhimento mínimo absoluto (LASSO)19, o estudo identifica o THBS1 como um gene diferencialmente expresso. O THBS1 demonstra alto desempenho na distinção entre pacientes com DHGNA e IM de controles saudáveis. (3) Análise de imunoinfiltração: O estudo realiza uma análise de imunoinfiltração, revelando níveis significativamente mais baixos de células T CD8+ e níveis mais altos de neutrófilos em pacientes com DHGNA e IM. (4) Análise de correlação: A pesquisa demonstra que o THBS1 está positivamente correlacionado com vários fatores imunológicos, incluindo CCR (receptor de quimiocina), MHC classe I (complexo principal de histocompatibilidade classe I), neutrófilos, parainflamação e células Tfh (T auxiliares foliculares). Está negativamente correlacionado com células T CD8+, atividade citolítica e linfócitos infiltrantes de tumor (TIL).

Protocolo

Os detalhes dos bancos de dados, links da web e softwares/pacotes usados estão listados na Tabela de Materiais. Os parâmetros de simulação utilizados são apresentados no Quadro 1.

1. Obtenção de conjuntos de dados de microarray de RNA

  1. Baixe o conjunto de dados de infarto do miocárdio (IM), GSE66360, do banco de dados NCBI-GEO .
  2. Baixe o conjunto de dados da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), GSE89632, do banco de dados NCBI-GEO .
  3. Certifique-se de que os conjuntos de dados baixados incluam 49 amostras de IM, 50 controles íntegros para GSE66360, 39 amostras de DHGNA e 24 controles íntegros para GSE89632.

2. Identificação dos DEG

  1. Pré-processamento de dados e identificação DEG
    1. Carregue os conjuntos de dados no RStudio usando as funções R apropriadas.
    2. Utilize o pacote R limma para identificar DEGs12 com os seguintes limites: P < 0,05P e | log FC | > 1,5.
    3. Use os pacotes R pheatmap, ggplot2 e Venn para gerar mapas de calor e diagramas de Venn para visualizar DEGs.
  2. Criar visualizações
    1. Use o mapa de calor para gerar mapas de calor de DEGs.
    2. Use ggplot2 para criar diagramas de Venn mostrando a sobreposição de DEGs entre NAFLD e MI.

3. Análise de enriquecimento

  1. Realizar análises de enriquecimento GO, KEGG e DO
    1. Carregue DEGs no pacote R clusterProfiler13.
    2. Realize a análise de enriquecimento de Ontologia Gênica (GO) para categorizar DEGs em funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares.
    3. Realize a análise da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) para mapear DEGs em vias bioquímicas.
    4. Use a análise de enriquecimento da Ontologia da Doença (DO) para vincular DEGs a estados clínicos específicos.

4. Análise de PPI através da construção de redes de PPI

  1. Use a plataforma online STRING 14 para construir diagramas de rede de interação proteína-proteína (PPI) de co-DEGs com uma pontuação de confiança de 0,4.
  2. Visualize as redes PPI usando o Cytoscape15.

5. Triagem de DEGs do hub de candidatos aplicando algoritmos de aprendizado de máquina

  1. Use os algoritmos de regressão SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) e LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) no RStudio para selecionar os DEGs mais relevantes 16,17,18.
  2. Certifique-se de que o SVM-RFE classifique e remova recursos iterativamente, enquanto a regressão LASSO19 aplica a regularização para identificar um conjunto esparso de DEGs.

6. Construção da curva ROC para avaliar o desempenho diagnóstico

  1. Use o RStudio para realizar a análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic)20.
  2. Calcule a área sob a curva (AUC) para co-DEGs cruciais.

7. Análise de imunoinfiltração para explorar a infiltração imunológica

  1. Realize a Análise de Enriquecimento de Conjunto de Genes de amostra única (ssGSEA) usando os pacotes R GSVA e GSEABase para analisar a infiltração imunológica na DHGNA e MI21.
  2. Compare a abundância relativa de tipos de células imunes entre amostras de DHGNA e IM e controles saudáveis.

8. Análise estatística

  1. Realize todas as análises estatísticas no RStudio.
  2. Aplique a análise de correlação de Pearson para examinar os padrões de co-expressão gênica.
  3. Garantir significância estatística com P < 0,05.
    NOTA: Certifique-se de que todos os pacotes de software e R estejam instalados corretamente e atualizados para suas versões mais recentes antes de iniciar o protocolo.

Resultados

Os principais achados do estudo proposto são apresentados aqui, abrangendo várias análises realizadas para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à DHGNA e ao IM.

Identificação dos DEGs
No conjunto de dados GSE89632, 76 genes regulados para cima e 20 para baixo foram identificados como NAFLD-DEGs (Figura 2B, D), enquanto o conjunto de dados GSE66360 revelou 118 genes regulados par...

Discussão

O método descrito neste estudo tem implicações significativas para a pesquisa dos mecanismos moleculares subjacentes à DHGNA e ao IM. Ao identificar biomarcadores importantes, como THBS1, o protocolo proposto oferece alvos potenciais para intervenções diagnósticas e terapêuticas. Essa abordagem pode ser estendida a outras doenças complexas envolvendo múltiplas vias e respostas imunes, facilitando a descoberta de novos biomarcadores e alvos terapêuticos. Além disso, a integra?...

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 62271511, U21A200949), Fundação Yucai do Hospital Geral do Comando do Teatro Sul (2022NZC011), Projeto do Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (2023A03J0170), Centro Nacional de Pesquisa Clínica para Geriatria (NCRCG-PLAGH-2023006) e Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (nº 2020A1515010288, nº 2021A1515220101).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1Used for visualizing protein-protein interaction (PPI) networks
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -To collect RNA microarray datasets for analysis
R package clusterProfilerBioconductor -Used for GO, KEGG, and DO enrichment analyses
R package ggplot2CRAN -Used for creating Venn diagrams and other visualizations
R package GSEABaseBioconductor -Used in conjunction with GSVA for gene set enrichment analysis
R package GSVABioconductor -Used for single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)
R package limmaBioconductor -Used for identifying differentially expressed genes (DEGs)
R package pheatmapCRAN -Used for generating heatmaps
R package vennCRAN -Used for creating Venn diagrams
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Publicly available RNA microarray datasets used for analysis
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717Integrated development environment for R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool for constructing PPI networks

Referências

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