JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה חקר את הקשרים בין מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) ואוטם שריר הלב (MI) באמצעות גנים המתבטאים במשותף, וזיהה את טרומבוספונדין 1 (THBS1) כסמן ביולוגי. ניתוח הסננה חיסונית חשף תאי CD8+ T ונויטרופילים כגורמי מפתח, כאשר THBS1 הראה פוטנציאל ככלי אבחון ל-NAFLD ו-MI.

Abstract

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) ואוטם שריר הלב (MI) הם שני נטל בריאותי עיקרי עם שכיחות ותמותה משמעותיים. מחקר זה נועד לחקור את הגנים המתבטאים במשותף כדי להבין את הקשר בין NAFLD ו-MI ולזהות סמנים ביולוגיים מכריעים פוטנציאליים של MI הקשור ל-NAFLD באמצעות ביואינפורמטיקה ולמידת מכונה. נערך ניתוח העשרה פונקציונלית, נבנתה דיאגרמת רשת אינטראקציה של חלבון-חלבון (PPI), ונעשה שימוש בטכניקות חיסול תכונות רקורסיביות של מכונה וקטורית (SVM-RFE) ואופרטור הצטמקות ובחירה מינימלי מוחלט (LASSO) כדי לזהות גן אחד המתבטא באופן דיפרנציאלי (DEG), טרומבוספונדין 1 (THBS1). THBS1 הראה ביצועים חזקים בהבחנה בין חולי NAFLD (AUC = 0.981) וחולי MI (AUC = 0.900). ניתוח הסננה חיסונית חשף תאי CD8+ T נמוכים משמעותית ורמות נויטרופילים גבוהות יותר בחולים עם NAFLD ו-MI. תאי CD8+ T ונויטרופילים היו יעילים בהבחנה בין NAFLD/MI לבקרות בריאות. ניתוח המתאם הראה כי THBS1 נמצא בקורלציה חיובית עם CCR (קולטן כימוקין), מחלקת MHC (מחלקה מורכבת תאימות היסטולוגית עיקרית), נויטרופילים, דלקת ו-Tfh (תאי T מסייעים זקיקים), ונמצא בקורלציה שלילית עם תאי CD8+ T, פעילות ציטוליטית ו-TIL (לימפוציטים חודרים לגידול) בחולי NAFLD ו-MI. THBS1 התגלה כסמן ביולוגי חדש לאבחון NAFLD/MI בהשוואה לבקרות בריאות. התוצאות מצביעות על כך שתאי CD8+ T ונויטרופילים יכולים לשמש כמאפיינים חיסוניים דלקתיים להבדיל בין חולים עם NAFLD/MI לבין אנשים בריאים.

Introduction

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא בעיה מרכזית בבריאות הציבור עם שכיחות של 25%-30%1. דווח כי השכיחות של NAFLD גבוהה בקרב חולי סוכרת2. עם זאת, המשמעות של NAFLD בחולים שאינם סוכרתיים עדיין אינה ברורה. מחקרים מצביעים על כך ש-NAFLD ממלא תפקיד עצמאי בפתוגנזה של טרשת עורקים 3,4. בנוסף, מטא-אנליזה הראתה כי NAFLD קשור קשר הדוק להסתיידות העורקים הכליליים, תפקוד לקוי של האנדותל וטרשת עורקים, והתגלה כגורם סיכון קרדיווסקולרי עצמאי5. הקשר בין NAFLD למחלות לב וכלי דם עדיין דורש מחקר נוסף.

אוטם שריר הלב (MI) היא מחלה קטסטרופלית המאיימת על הבריאות ומטילה נטל כלכלי משמעותי על חולים ובני משפחותיהם ברחבי העולם6. MI הוא גם גורם מוות עיקרי בחולים עם NAFLD. מחקר קליני שפורסם בכתב העת הרפואי הבריטי הראה כי הסיכון לאוטם שריר הלב בחולי NAFLD גדול פי 1.17 מאשר בחולים שאינם NAFLD 7,8. מחקרים מסוימים זיהו מסלולים מולקולריים, כולל דלקת, מתח חמצוני ומטבוליזם של שומנים, התורמים ל-MI 9,10,11 הקשור ל-NAFLD. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים המקשרים בין NAFLD ו-MI נותרו לא ברורים. חיוני לזהות סמנים ביולוגיים חדשים הקשורים לפרוגנוזה של NAFLD ו-MI.

השכיחות הגוברת של NAFLD, המשפיעה על פלח רחב של האוכלוסייה, מדגישה בעיה משמעותית בבריאות הציבור, במיוחד בהתחשב בקשר שלה לסוכרת. עם זאת, ההשפעה של NAFLD על חולים שאינם סוכרתיים נותרה לא מובנת היטב. NAFLD מעורב בפתוגנזה של טרשת עורקים ומוכר כגורם סיכון קרדיווסקולרי עצמאי, בהיותו קשור קשר הדוק להסתיידות העורקים הכליליים, תפקוד לקוי של האנדותל וטרשת עורקים. למרות הקשרים הללו, המנגנונים המדויקים המגשרים בין NAFLD ומחלות לב וכלי דם כגון אוטם שריר הלב (MI) דורשים הבהרה נוספת. MI הוא אחד מגורמי התמותה המובילים בעולם ומטיל נטל כלכלי משמעותי. הסיכון ל-MI בחולי NAFLD גבוה באופן משמעותי מאשר אצל אלה ללא NAFLD, מה שמדגיש את הצורך בהבנה עמוקה יותר של המסלולים המולקולריים המחברים בין מצבים אלה. אמנם דלקת, עקה חמצונית וחילוף חומרים של שומנים הוצעו כגורמים תורמים, אבל המנגנונים המדויקים עדיין לא ברורים. יש צורך דחוף לזהות סמנים ביולוגיים חדשים שיכולים לספק תובנות לגבי הפרוגנוזה והניהול של MI הקשור ל-NAFLD.

כתוצאה מכך, במחקר זה, מערכי נתונים של מיקרו-מערך RNA עבור NAFLD ו-MI הורדו מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי-ביטוי גנים אומניבוס (NCBI-GEO, ראה טבלת חומרים) כדי לזהות ולנתח את האינטראקציה של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) בין NAFLD ו-MI. ניתוח העשרה, בניית דיאגרמת רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), תמיכה בחיסול תכונות רקורסיביות של מכונה וקטורית (SVM-RFE), ואלגוריתמים של אופרטור הצטמקות ובחירה הכי פחות מוחלט (LASSO) שימשו לזיהוי גנים מרכזיים 12,13,14,15,16,17,18,19. ניתוח הסננה חיסונית בוצע כדי לבחון תאים חיסוניים בחולי NAFLD ו-MI. בסופו של דבר, שיטות אלה שולבו כדי להבהיר את הקשר בין NAFLD ו-MI. איור 1 ממחיש את רצף התכנון שבוצע במחקר זה. על ידי שילוב של ביואינפורמטיקה, למידת מכונה וניתוח הסננה חיסונית, מחקר זה נועד לתרום לפיתוח פלטפורמה חדשה לתמיכה בהחלטות רפואיות.

התרומות העיקריות של מאמר זה הן: (1) זיהוי גנים המתבטאים במשותף: המחקר מדגיש את הקשר בין NAFLD ו-MI על ידי זיהוי גנים המתבטאים במשותף, ומציע הבנה מעמיקה יותר של הקשרים המולקולריים בין שני המצבים הללו. (2) יישום של ביואינפורמטיקה ולמידת מכונה: תוך שימוש בטכניקות ביואינפורמטיקה ולמידת מכונה, כולל חיסול תכונות רקורסיביות של מכונה וקטורית תומכת (SVM-RFE)17 ואופרטור הצטמקות ובחירה הכי פחות מוחלט (LASSO)19, המחקר מזהה THBS1 כגן המתבטא באופן דיפרנציאלי. THBS1 מדגים ביצועים גבוהים בהבחנה בין חולי NAFLD ו-MI לבין בקרות בריאות. (3) ניתוח הסננה חיסונית: המחקר מבצע ניתוח הסננה חיסונית, וחושף רמות נמוכות משמעותית של תאי CD8+ T ורמות גבוהות יותר של נויטרופילים בחולים עם NAFLD ו-MI. (4) ניתוח מתאם: המחקר מוכיח כי THBS1 נמצא בקורלציה חיובית עם מספר גורמים חיסוניים, כולל CCR (קולטן כימוקין), MHC Class I (קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי Class I), נויטרופילים, דלקת פרה-דלקתית, ותאי Tfh (תאי T מסייעים זקיקים). יש לו קורלציה שלילית עם תאי CD8+ T, פעילות ציטוליטית ולימפוציטים חודרים לגידול (TIL).

Protocol

פרטי מסדי הנתונים, קישורי האינטרנט והתוכנות/החבילות שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים. פרמטרי הסימולציה המשמשים מסופקים בטבלה 1.

1. השגת מערכי נתונים של מיקרו-מערך RNA

  1. הורד את מערך הנתונים של אוטם שריר הלב (MI), GSE66360, ממסד הנתונים של NCBI-GEO .
  2. הורד את מערך הנתונים של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), GSE89632, ממסד הנתונים של NCBI-GEO .
  3. ודא שמערכי הנתונים שהורדת כוללים 49 דגימות MI, 50 בקרות בריאות עבור GSE66360, 39 דגימות NAFLD ו-24 בקרות בריאות עבור GSE89632.

2. זיהוי DEGs

  1. עיבוד מקדים של נתונים וזיהוי DEG
    1. טען את מערכי הנתונים ל-RStudio באמצעות פונקציות R מתאימות.
    2. השתמש בלימה של חבילת R כדי לזהות DEGs12 עם הספים הבאים: P < 0.05P ו- | log FC | > 1.5.
    3. השתמש בחבילות R pheatmap, ggplot2 ו-Venn כדי ליצור מפות חום ודיאגרמות Venn להמחשת DEGs.
  2. יצירת תצוגות חזותיות
    1. השתמש במפת pheatmap כדי ליצור מפות חום של DEGs.
    2. השתמש ב- ggplot2 כדי ליצור דיאגרמות חיתוך קבוצות המציג את החפיפה של DEGs בין NAFLD ל- MI.

3. ניתוח העשרה

  1. בצע ניתוח העשרה של GO, KEGG ו-DO
    1. טען DEGs לתוך חבילת R clusterProfiler13.
    2. לבצע ניתוח העשרה של אונטולוגיה גנטית (GO) כדי לסווג DEGs לפונקציות מולקולריות, תהליכים ביולוגיים ורכיבים תאיים.
    3. בצע ניתוח מסלול של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) כדי למפות DEGs למסלולים ביוכימיים.
    4. השתמש בניתוח העשרה של אונטולוגיה של מחלות (DO) כדי לקשר DEGs למצבים קליניים ספציפיים.

4. ניתוח PPI על ידי בניית רשתות PPI

  1. השתמש בפלטפורמה המקוונת STRING 14 כדי לבנות דיאגרמות רשת של אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) של co-DEGs עם ציון ביטחון של 0.4.
  2. דמיין את רשתות ה-PPI באמצעות Cytoscape15.

5. סינון DEGs של מרכז מועמדים על ידי יישום אלגוריתמים של למידת מכונה

  1. השתמש באלגוריתמי רגרסיה SVM-RFE (תמיכה ב-Vector Machine-Recursive Feature Elimination) ו-LASSO (Least Absolute Contractage and Selection Operator) ב-RStudio כדי לבחור את ה-DEGs הרלוונטיים ביותר 16,17,18.
  2. ודא ש-SVM-RFE מדרג ומסיר תכונות באופן איטרטיבי, בעוד רגרסיה19 של LASSO מחילה רגולציה כדי לזהות קבוצה דלילה של DEGs.

6. בניית עקומת ROC להערכת ביצועי אבחון

  1. השתמש ב-RStudio כדי לבצע ניתוח עקומת ROC (מאפיין הפעלה של מקלט)20.
  2. חשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) עבור משותפים מכריעים.

7. ניתוח הסננה חיסונית לחקר חדירה חיסונית

  1. בצע ניתוח העשרת מערך גנים בדגימה אחת (ssGSEA) באמצעות חבילות R GSVA ו-GSEABase כדי לנתח חדירה חיסונית ב-NAFLD ו-MI21.
  2. השווה את השפע היחסי של סוגי תאים חיסוניים בין דגימות NAFLD ו-MI ובקרות בריאות.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים ב-RStudio.
  2. ליישם ניתוח מתאם פירסון כדי לבחון דפוסי ביטוי משותף של גנים.
  3. הבטח מובהקות סטטיסטית עם P < 0.05.
    הערה: ודא שכל התוכנות וחבילות R מותקנות כהלכה ומעודכנות לגרסאות העדכניות ביותר שלהן לפני הפעלת הפרוטוקול.

תוצאות

הממצאים העיקריים של המחקר המוצע מוצגים כאן, המקיפים ניתוחים שונים שנערכו כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס NAFLD ו-MI.

זיהוי DEGs
במערך הנתונים של GSE89632, 76 גנים מווסתים כלפי מעלה ו-20 גנים מווסתים למטה זוהו כ-NAFLD-DEGs (איור 2B,D

Discussion

לשיטה המתוארת במחקר זה יש השלכות משמעותיות על מחקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס NAFLD ו-MI. על ידי זיהוי סמנים ביולוגיים מרכזיים כגון THBS1, הפרוטוקול המוצע מציע יעדים פוטנציאליים להתערבויות אבחנתיות וטיפוליות כאחד. ניתן להרחיב גישה זו למחלות מורכבות אחרות הכוללות מס...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 62271511, U21A200949), קרן יוקאי של בית החולים הכללי של פיקוד הזירה הדרומית (2022NZC011), פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (2023A03J0170), המרכז הלאומי למחקר קליני לגריאטריה (NCRCG-PLAGH-2023006) וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (מס' 2020A1515010288, מס' 2021A1515220101).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1Used for visualizing protein-protein interaction (PPI) networks
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -To collect RNA microarray datasets for analysis
R package clusterProfilerBioconductor -Used for GO, KEGG, and DO enrichment analyses
R package ggplot2CRAN -Used for creating Venn diagrams and other visualizations
R package GSEABaseBioconductor -Used in conjunction with GSVA for gene set enrichment analysis
R package GSVABioconductor -Used for single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)
R package limmaBioconductor -Used for identifying differentially expressed genes (DEGs)
R package pheatmapCRAN -Used for generating heatmaps
R package vennCRAN -Used for creating Venn diagrams
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Publicly available RNA microarray datasets used for analysis
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717Integrated development environment for R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool for constructing PPI networks

References

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907 (2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47 (2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123 (2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972 (2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371 (2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907 (2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50 (2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570 (2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1SVM RFELASSOT CD8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved