通过免疫浸润分析鉴定非酒精性脂肪肝中血小板反应蛋白 1 的医学决策支持平台

本研究通过共表达基因调查了非酒精性脂肪肝 （NAFLD） 与心肌梗死 （MI） 之间的关系，将血小板反应蛋白 1 （THBS1） 确定为生物标志物。免疫浸润分析显示 CD8+ T 细胞和中性粒细胞是关键因素，THBS1 有望作为 NAFLD 和 MI 的诊断工具。

非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 和心肌梗塞 （MI） 是两个主要的健康负担，患病率和死亡率都很高。本研究旨在探索共表达基因，以了解 NAFLD 与 MI 之间的关系，并使用生物信息学和机器学习确定 NAFLD 相关 MI 的潜在关键生物标志物。进行功能富集分析，构建辅蛋白-蛋白相互作用 （PPI） 网络图，采用支持向量机器递归特征消除 （SVM-RFE） 和最小绝对收缩和选择运算符 （LASSO） 技术鉴定一个差异表达基因 （DEG），血小板反应蛋白 1 （THBS1）。THBS1 在区分 NAFLD 患者 （AUC = 0.981） 和 MI 患者 （AUC = 0.900） 方面表现出强大的性能。免疫浸润分析显示 NAFLD 和 MI 患者的 CD8+ T 细胞水平显著降低，中性粒细胞水平升高。CD8+ T 细胞和中性粒细胞可有效区分 NAFLD/MI 与健康对照。相关性分析显示，THBS1 与 CCR （趋化因子受体） 、MHC 分级 （主要组织相容性复合物类别）、中性粒细胞、副炎症和 Tfh （滤泡辅助性 T 细胞）呈正相关，与 CD8+ T 细胞、溶细胞活性和 TIL （肿瘤浸润淋巴细胞） 呈负相关在 NAFLD 和 MI 患者中。与健康对照相比，THBS1 成为诊断 NAFLD/MI 的新型生物标志物。结果表明，CD8+ T 细胞和中性粒细胞可以作为炎症免疫特征，用于区分 NAFLD/MI 患者和健康个体。

非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 是一个主要的公共卫生问题，患病率为 25%-30%¹。据报道，糖尿病患者 NAFLD 的患病率很高²。然而，NAFLD 在非糖尿病患者中的意义尚不清楚。研究表明，NAFLD 在动脉粥样硬化的发病机制中起独立作用 ^3,4。此外，一项荟萃分析表明，NAFLD 与冠状动脉钙化、内皮功能障碍和动脉粥样硬化密切相关，并已成为独立的心血管危险因素⁵。NAFLD 与心血管疾病之间的联系仍需进一步研究。

心肌梗塞 （MI） 是一种灾难性疾病，威胁健康，给全世界的患者及其家人带来沉重的经济负担⁶。心肌梗死也是 NAFLD 患者死亡的主要原因。发表在《英国医学杂志》上的一项临床研究表明，NAFLD 患者发生心肌梗死的风险是非 NAFLD 患者的 1.17 倍 ^7,8。一些研究已经确定了导致 NAFLD 相关 MI 的分子途径，包括炎症、氧化应激和脂质代谢 ^9,10,11。然而，将 NAFLD 与 MI 联系起来的潜在机制仍不清楚。确定与 NAFLD 和 MI 预后相关的新生物标志物至关重要。

NAFLD 的患病率不断增加，影响着广泛的人群，这凸显了一个重大的公共卫生问题，特别是考虑到它与糖尿病的关联。然而，NAFLD 对非糖尿病患者的影响仍然知之甚少。NAFLD 与动脉粥样硬化的发病机制有关，被认为是一种独立的心血管危险因素，与冠状动脉钙化、内皮功能障碍和动脉粥样硬化密切相关。尽管存在这些关联，但桥接 NAFLD 和心血管疾病（如心肌梗死 （MI））的确切机制需要进一步阐明。心肌梗死是全球死亡的主要原因之一，并造成了沉重的经济负担。NAFLD 患者发生 MI 的风险明显高于没有 NAFLD 的患者，这凸显了更深入地了解连接这些疾病的分子途径的必要性。虽然炎症、氧化应激和脂质代谢被认为是促成因素，但确切的机制尚不清楚。迫切需要确定新的生物标志物，这些生物标志物可以为 NAFLD 相关 MI 的预后和管理提供见解。

因此，在本研究中，从国家生物技术信息基因表达综合中心（NCBI-GEO，见材料表）下载了 NAFLD 和 MI 的 RNA 微阵列数据集，以识别和分析 NAFLD 和 MI 之间差异表达基因 （DEG） 的相互作用。富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络图构建、支持向量机递归特征消除 （SVM-RFE）、 最小绝对收缩和选择运算符 （LASSO） 算法用于鉴定枢纽基因^{12 ，13 ，14 ，15 ，16 ，17 ，18 ，19}。进行免疫浸润分析以检查 NAFLD 和 MI 患者的免疫细胞。最终，这些方法被整合以阐明 NAFLD 和 MI 之间的关系。图 1 说明了本研究中遵循的设计顺序。通过结合生物信息学、机器学习和免疫浸润分析，本研究旨在为开发新型医疗决策支持平台做出贡献。

本文的主要贡献是：（1） 共表达基因的鉴定：该研究通过鉴定共表达基因来强调 NAFLD 和 MI 之间的关系，从而更深入地了解这两种情况之间的分子联系。（2） 生物信息学和机器学习的应用：利用生物信息学和机器学习技术，包括支持向量机递归特征消除 （SVM-RFE）¹⁷ 和最小绝对收缩和选择运算符 （LASSO）¹⁹，该研究将 THBS1 确定为差异表达基因。THBS1 在区分 NAFLD 和 MI 患者与健康对照者方面表现出高性能。（3） 免疫浸润分析：该研究进行了免疫浸润分析，揭示了 NAFLD 和 MI 患者的 CD8+ T 细胞水平显着降低，中性粒细胞水平升高。（4） 相关性分析：研究表明，THBS1 与多种免疫因素呈正相关，包括 CCR（趋化因子受体）、MHC I 类（主要组织相容性复合物 I 类）、中性粒细胞、 副炎症和 Tfh （滤泡辅助性 T） 细胞。它与 CD8+ T 细胞、溶细胞活性和肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 呈负相关。

资料 表中列出了所使用的数据库、Web 链接和软件/软件包的详细信息。 表 1 中提供了使用的仿真参数。

1. 获取 RNA 微阵列数据集

1. 从 NCBI-GEO 数据库下载心肌梗死 （MI） 数据集 GSE66360。
2. 从 NCBI-GEO 数据库下载非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 数据集 GSE89632。
3. 确保下载的数据集包括 49 个 MI 样本、50 个 GSE66360 个健康对照、39 个 NAFLD 样本和 24 个 GSE89632 健康对照。

2. DEGs的识别

1. 数据预处理和 DEG 识别
   1. 使用适当的 R 函数将数据集加载到 RStudio 中。
   2. 利用 R 软件包 limma 识别具有以下阈值的 DEG¹² ： P < 0.05P 和 | log FC | > 1.5。
   3. 使用 R 包 pheatmap、 ggplot2 和 Venn 生成热图和维恩图，以可视化 DEG。
2. 创建可视化
   1. 使用 pheatmap 生成 DEG 的热力图。
   2. 使用 ggplot2 创建维恩图，显示 NAFLD 和 MI 之间 DEG 的重叠。

3. 富集分析

1. 执行 GO、KEGG 和 DO 富集分析
   1. 将 DEG 加载到 R 软件包 clusterProfiler¹³ 中。
   2. 进行基因本体论 （GO） 富集分析，将 DEG 分类为分子功能、生物过程和细胞成分。
   3. 执行京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 通路分析，将 DEG 映射到生化通路上。
   4. 使用疾病本体 （DO） 富集分析将 DEG 与特定临床状态联系起来。

4. 通过构建 PPI 网络进行 PPI 分析

1. 使用 STRING 在线平台¹⁴ 构建 co-DEGs 的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络图，置信度评分为 0.4。
2. 使用 Cytoscape¹⁵ 可视化 PPI 网络。

5. 通过应用机器学习算法筛选候选中心 DEG

1. 在 RStudio 中使用 SVM-RFE（支持向量机递归特征消除）和 LASSO（最小绝对收缩和选择运算符）回归算法来选择最相关的 DEG^16、17、18。
2. 确保 SVM-RFE 迭代地对特征进行排名和删除，而 LASSO 回归¹⁹ 应用正则化来识别一组稀疏的 DEG。

6. 用于评估诊断性能的 ROC 曲线构建

1. 使用 RStudio 进行 ROC （受试者工作特征）曲线分析²⁰.
2. 计算关键 co-DEG 的曲线下面积 （AUC）。

7. 免疫浸润分析，探索免疫浸润

1. 使用 R 软件包 GSVA 和 GSEABase 进行单样本基因集富集分析 （ssGSEA），以分析 NAFLD 和 MI²¹ 中的免疫浸润。
2. 比较 NAFLD 和 MI 样品与健康对照之间免疫细胞类型的相对丰度。

8. 统计分析

1. 在 RStudio 中执行所有统计分析。
2. 应用 Pearson 相关性分析来检查基因共表达模式。
3. 确保 P < 0.05 的统计显着性。
   注意：在启动协议之前，请确保所有软件和 R 软件包都已正确安装并更新到最新版本。

本文介绍了拟议研究的主要发现，包括为阐明 NAFLD 和 MI 的分子机制而进行的各种分析。

DEG 的识别
在 GSE89632 数据集中，76 个上调和 20 个下调基因被鉴定为 NAFLD-DEGs（图 2B，D），而 GSE66360 数据集显示 118 个上调和 8 个下调基因为 MI-DEGs（图 2C，E）。随后，从 NAFLD-DEG...

本研究中描述的方法对研究 NAFLD 和 MI 的分子机制具有重要意义。通过识别 THBS1 等关键生物标志物，拟议的方案为诊断和治疗干预提供了潜在靶点。这种方法可以扩展到涉及多种途径和免疫反应的其他复杂疾病，促进发现新的生物标志物和治疗靶点。此外，生物信息学和机器学习技术的整合为个性化医疗提供了一个多功能框架，允许根据个体分子特征定制治疗策略。这种...

没有。

本研究得到国家自然科学基金（62271511、U21A200949）、南方战区总医院育才基金（2022NZC011）、广州市科技计划项目（2023A03J0170）、国家老年医学临床医学研究中心（NCRCG-PLAGH-2023006）和广东省基础与应用基础研究基金（No.2020A1515010288、No.2021A1515220101）。