Projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra

Um método inovador para a fabricação de dispositivos microfluídicos usando laminação de tereftalato de polietileno (PET) reduz significativamente o custo e a complexidade de capturar e criar imagens de vários embriões vivos de peixe-zebra.

Os embriões de peixe-zebra são transparentes e, portanto, adequados exclusivamente para imagens intravitais não invasivas de processos fundamentais, como cicatrização de feridas e migração de células imunológicas. Dispositivos microfluídicos são usados para aprisionamento para suportar imagens de longo prazo de organismos multicelulares, incluindo peixe-zebra. No entanto, a fabricação desses dispositivos usando litografia suave requer instalações especializadas e competência em impressão 3D, que podem não ser acessíveis a todos os laboratórios. Nossa adaptação de um método de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo desenvolvido anteriormente para a construção de dispositivos microfluídicos aumenta a acessibilidade, permitindo a fabricação e iteração do projeto por uma fração do investimento técnico das técnicas convencionais. Usamos um dispositivo feito com esse método, o Assistente Rotacional para Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), para acomodar tratamento medicamentoso, ferimento manual e imagens de longo prazo de até quatro embriões no mesmo campo de visão. Com este novo design, capturamos com sucesso as características morfológicas macroscópicas do sinal de cálcio em torno da ablação a laser e feridas de transecção manual para vários embriões nas 2 h imediatamente após a lesão, bem como o recrutamento de neutrófilos para a borda da ferida por 24 h.

A capacidade de responder adequadamente a lesões é fundamental para a sobrevivência de todos os organismos em todas as escalas, desde uma única célula até vários tecidos. Ferimentos e suas respostas associadas, como o recrutamento de fagócitos para áreas danificadas¹ são, portanto, tópicos significativos na biologia celular e tecidual. As feridas são detectadas imediatamente após a quebra da barreira tecidual, causando uma resposta de gradiente tecidual envolvendo a contração da ferida ^2,3 que coordena a cicatrização da ferida e o subsequente crescimento⁴. Devido à natureza mecânica dessa contração, as ferramentas usadas durante a experimentação não devem impedir fisicamente o movimento das células próximas ao local da lesão.

Os embriões de peixe-zebra são um excelente modelo para estudar o desenvolvimento e a doença, incluindo a resposta a feridas de vertebrados, devido à sua facilidade de tratamento, tratabilidade genética e transparência óptica ^5,6. No entanto, imobilizar todo o organismo por um período prolongado é necessário para estudar o comportamento de longo prazo das células próximas a um local de lesão. A incorporação de embriões em agarose de baixo ponto de fusão é suficiente para imagens de curto prazo de tecido não ferido. No entanto, a matriz de gel circundante restringe a contração e o relaxamento das feridas e impede o crescimento dos embriões em desenvolvimento ao longo do tempo ^7,8,9.

Dispositivos microfluídicos podem imobilizar embriões de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento 10,11,12,13,14,15,16, e alguns, como o zWEDGI 7, acomodam ferimentos manuais. No entanto, existem várias desvantagens nos designs de dispositivos disponíveis. Por exemplo, muitos dispositivos impressos diretamente em plástico são incompatíveis com imagens em sistemas de microscópio invertido devido à baixa transparência óptica. Além disso, os canais paralelos permitem imagens multiposicionais^10,11, mas o movimento físico da platina do microscópio introduz atraso na aquisição da imagem. A iteração e otimização repetidas para resolver esses problemas são difíceis quando se considera o investimento financeiro e técnico necessário para cada novo projeto, especialmente para os métodos atuais padrão-ouro de fabricação de dispositivos usando litografia suave de polidimetilsiloxano (PDMS). A primeira etapa, a criação de um molde mestre, geralmente requer conhecimento de software de modelagem 3D, acesso a equipamentos de fabricação especializados e (dependendo do material usado) um tratamento antiaderente adicional, como silanização, antes que o molde seja usado. A cura do PDMS, uma vez derramado, leva pelo menos uma hora em altas temperaturas e, geralmente, deve ser feita sob vácuo ou com pinça para obter melhores resultados, geralmente em uma sala limpa ^7,17,18. Como na biologia do desenvolvimento, esses custos podem rapidamente se mostrar proibitivos para experimentos que exigem muitos ambientes microfluídicos exclusivos em vários modelos.

Dos materiais de construção alternativos disponíveis, o tereftalato de polietileno (PET) é durável, não tóxico e fácil de manipular. As folhas de PET são bolsas de laminação de plástico amplamente disponíveis na maioria das lojas de material de escritório, com adesivo termicamente ativado pré-aplicado (geralmente acetato de vinil etileno). Ao moldar essas folhas de PET usando cortadores artesanais disponíveis comercialmente (ou seja, plotters de corte controlados por computador projetados para artesãos domésticos) e aderir as camadas umas às outras usando equipamentos de laminação térmica padrão, uma ampla gama de projetos potenciais pode ser gerada e iterada rapidamente. Portanto, adaptamos um método de projeto e construção descrito anteriormente envolvendo PET¹⁸ empilhado para criar o assistente Apara Danio Imaging de Subsequent Healing (RADISH) (Figura 1A, B). Um arranjo rotacional de vários canais de contenção em forma de cunha otimiza a proximidade, permitindo espaço para a transecção manual da barbatana caudal, acomodando imagens imediatamente após a lesão e imagens simultâneas de longo prazo de vários embriões de peixe-zebra feridos no mesmo campo de visão. Além disso, esse método de construção reduz drasticamente os custos iniciais de capital e o tempo necessário para a construção do dispositivo, mantendo a reutilização.

Este estudo usou embriões 3 dias após a fertilização (dpf), mas pode ser projetado para usar embriões de 2 a 14 dpf. O experimento do peixe-zebra foi conduzido por padrões internacionalmente aceitos. O Protocolo de Cuidados e Uso de Animais foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Purdue (PACUC), aderindo às Diretrizes para o uso de peixe-zebra no Programa de Pesquisa Intramural do NIH (número do protocolo: 1401001018).

1. Montagem do dispositivo microfluídico PET

NOTA: Qualquer parte deste protocolo pode ser pausada a qualquer momento, exceto nas etapas 1.8 e 1.9, que são sensíveis ao tempo de secagem do cianoacrilato.

1. Projete o padrão para o dispositivo no software de sua escolha (por exemplo, Adobe Illustrator, Figura 1A). Dependendo da idade e do tamanho do embrião, ajuste a largura do canal e o tamanho da câmara central de imagem para melhor ajuste.
   1. Salve cada camada como um arquivo de imagem individual com dimensões idênticas. Nomeie cada arquivo de forma que a espessura da chapa a ser usada e a ordem de montagem sejam evidentes.
2. Inicialize a máquina de corte de acordo com as instruções do fabricante.
3. Carregue cada padrão projetado no software de design para corte.
   1. Na área de trabalho de design, selecione os designs recém-carregados. Agrupe os padrões destinados à mesma espessura de chapa de PET no mesmo corte (Figura 2A). Se necessário, reajuste o tamanho dos padrões no software de design para as dimensões corretas.
   2. Confirme o número e o tipo de padrões no corte e selecione o material cortado.
      NOTA: As folhas de PET podem não ser uma escolha de material no software de design, inclusive com nomes como "bolsa de plastificação de plástico". Qualquer material de espessura e textura semelhantes (por exemplo, folhas de transparência ou vinil não adesivo) pode ser selecionado.
   3. Prenda as folhas de PET na esteira de corte, pressionando firmemente para remover as bolhas de ar, e carregue a esteira na máquina de corte. Siga as instruções na tela para solicitar que a máquina de corte inicie o corte.
   4. Remova os cortes acabados da esteira de corte. Se necessário, ajuste os padrões de corte usando uma faca artesanal ou lâmina de bisturi.
      NOTA: Os arquivos de imagem usados para criar o design RADISH (Figura 1A) estão disponíveis para download como formatos de arquivo vetorial e PNG (Arquivo Suplementar 1). Se a máquina de corte estiver levantando, rasgando ou falhando em cortar a folha de PET, considere substituir a esteira de corte.
4. Alinhe as camadas em lamínula, sem assistência ou com marcas de registro pré-cortadas. Se várias camadas puderem ser fixadas juntas antes da laminação, alinhe-as simultaneamente.
5. Prenda as camadas com fita adesiva para evitar deslocamento durante a laminação (Figura 2B). Dependendo do tamanho do dispositivo e da capacidade do laminador, monte pequenos designs em um suporte maior com mais fita adesiva para evitar emperrar ou entupir a alimentação do laminador (Figura 2C).
   NOTA: O suporte usado na laminação NÃO é o mesmo que o tapete de corte e serve principalmente para fornecer tração para o laminador. Qualquer material resistente ao calor de espessura insignificante funcionará como suporte (incluindo, mas não se limitando a, cartolina, papel de escritório dobrado ou uma folha PET maior).
6. Ligue o laminador e o laminado de acordo com as instruções do fabricante. Remova a fita adesiva do escritório antes de alinhar a próxima camada (Figura 2D).
7. Repita as etapas 1.4 a 1.6 até que todas as camadas tenham sido respeitadas.
8. Prenda o dispositivo a um prato de 35 mm perfurado com um orifício de 3/4" usando cola de cianoacrilato (Figura 2E,F). Ajuste a forma e o tipo do prato de acordo com as necessidades experimentais (por exemplo, qualquer recipiente grande o suficiente para acomodar o dispositivo - um poço em uma placa de 24 poços ou uma placa de Petri maior). Use cola suficiente para selar totalmente o dispositivo no prato sem inundá-lo.
   NOTA: Não é necessário prender o dispositivo a um prato de retenção para o funcionamento do dispositivo. CUIDADO: O cianoacrilato une a pele e os olhos em segundos e irrita o sistema respiratório, os olhos e a pele. Use proteção para as mãos e os olhos e trabalhe em uma área bem ventilada.
9. Impermeabilize o laminado PET revestindo completamente as bordas externas do dispositivo com cola de cianoacrilato (Figura 2F). Use cola suficiente para cobrir totalmente as bordas externas. Deixe a cola curar por pelo menos 2 h antes de usar.
   NOTA: Garanta espaço adequado para a ventilação dos vapores de cianoacrilato. O acúmulo de fumaça pode fazer com que o cianoacrilato se deposite no dispositivo, obscurecendo o material opticamente transparente.

2. Posicionamento dos embriões dentro do RADISH e preparação para imagem

1. Crie embriões de peixe-zebra no meio padrão de criação de embriões E3¹⁹. Se necessário, descorione os embriões pelo menos 1 h antes da imagem para permitir que eles se achatem. Este experimento usou embriões a 3 dpf, mas os embriões podem ter até 14 dpf (Figura 1E).
2. Manchar ou tratar os embriões de acordo com as necessidades experimentais.
   NOTA: Nesses experimentos, as membranas celulares da camada epitelial externa foram coradas, quando relevante, por incubação com 100 nM MemGlow 560.
3. Anestesiar embriões com 164 mg/L MS-222²⁰.
   NOTA: A concentração exata e o anestésico usado podem ser ajustados de acordo com a preferência do experimentador. A concentração de anestésico pode ser reduzida para permitir o desenvolvimento bem-sucedido durante imagens de longo prazo (ver etapa 4.1).
4. Encha o prato de retenção contendo o dispositivo montado com 5 mL de E3 contendo 164 mg / L MS-222.
5. Usando uma pipeta de transferência, deposite um embrião anestesiado em cada câmara de retenção do dispositivo. Certifique-se de que os embriões permaneçam submersos em líquido durante a imagem.
   NOTA: O design RADISH pode imobilizar 1-4 embriões.
6. Usando uma alça de cabelo, oriente os embriões de forma que a cauda do embrião se projete para dentro da câmara de imagem central e a gema seja imobilizada com segurança no canal em forma de cunha (Figura 1C).
   NOTA: A orientação dos embriões pode ser realizada sob um estereomicroscópio para facilitar a manipulação.
7. Se desejar, prenda a cabeça do embrião adicionando 1,5% de agarose de baixo ponto de fusão na câmara de retenção usando uma micropipeta.
8. Mova o dispositivo com embriões para o sistema de imagem de sua escolha para iniciar a imagem.

3. Imagem de transientes de cálcio após ferimento

NOTA: Esta seção e a Seção 4 são opcionais e fornecidas como experimentos de amostra em potencial.

1. Selecione o sistema e a objetiva apropriados para a geração de imagens.
   NOTA: Aqui, um confocal de varredura a laser invertido foi equipado com uma objetiva de 20x.
2. Ajuste o foco da amostra e os parâmetros de imagem (por exemplo, potência do laser: 5, ganho: 90, tamanho do orifício: 2 UA, tempo de exposição [velocidade de varredura: 1 quadro/s]) para obter a relação sinal-ruído e a velocidade de aquisição ideais.
   NOTA: Recomenda-se que as amostras sejam pré-focadas e os parâmetros para cada canal no sistema de imagem de escolha sejam ajustados antes da ferida para reduzir o atraso entre a formação da ferida e a aquisição da imagem.
3. Ferida em um embrião Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^{xt18 21,22}.
   1. Para enrolar o embrião por meio de transecção manual, aplique pressão com uma lâmina de bisturi no tecido da barbatana caudal na ponta da notocorda sob um estereomicroscópio (Vídeo 1) e, em seguida, retorne o dispositivo ao palco.
      CUIDADO: Aplicar pressão excessiva com a lâmina do bisturi pode rachar o vidro subjacente. Se o vidro rachar, descarte o dispositivo e reinicie a partir da Etapa 1.2.
   2. Para enrolar o embrião por meio de estimulação a laser, defina uma região de interesse (ROI) perto da borda da dobra da barbatana caudal e estimule de acordo com a potência do laser disponível.
      NOTA: Aqui, uma potência de laser de 2,4 W por 30 s a 800 nm foi suficiente para induzir uma ferida de espessura total.
4. Imagem à temperatura ambiente usando canais GFP (excitação 488 nm, emissão 510 nm) e RFP (excitação 561 nm, emissão 610 nm) usando um intervalo de quadro de 1 min para um total de 1 h.
5. (Opcional): Se necessário, libere os embriões para recuperação após a imagem por meio de sucção suave perto da cabeça usando uma pipeta de transferência ou girando o prato.

4. Imagem do recrutamento de neutrófilos após ferimento

1. Pelo menos 1 h antes da imagem, transfira os embriões para E3 contendo metade da concentração padrão de anestésico, neste caso, 82 mg/L MS-222.
2. Selecione a objetiva apropriada para a imagem (aqui, um confocal de varredura a laser invertido equipado com uma objetiva de 10x).
3. Ajuste o foco da amostra e os parâmetros de imagem (por exemplo, potência do laser: 5, ganho: 90, tamanho do orifício: 2 UA, tempo de exposição [velocidade de varredura: 0,5 quadro/s])) para obter a relação sinal-ruído e a velocidade de aquisição ideais.
   NOTA: Recomenda-se que as amostras sejam pré-focadas e os parâmetros para cada canal no sistema de imagem de escolha sejam ajustados antes da ferida para reduzir o atraso entre a formação da ferida e a aquisição da imagem.
4. Enrole quatro embriões Tol2(mpx:Dendra2)²³ por meio de transecção manual, aplicando pressão com uma lâmina de bisturi no tecido da barbatana caudal sob um estereomicroscópio e, em seguida, retorne o dispositivo ao palco.
5. Capture a imagem no canal GFP (excitação 488 nm, emissão 510 nm) à temperatura ambiente usando um intervalo de quadro de 5 min por 24 h.
6. Se necessário, libere os embriões para recuperação após a imagem por meio de sucção suave perto da cabeça usando uma pipeta de transferência ou girando o prato.

Para comparação da qualidade da imagem produzida por um confocal de varredura a laser com e sem o auxílio do RADISH, os embriões que expressam o biossensor intensiométrico de cálcio GCaMP6f^22,24 na camada epitelial externa foram corados usando MemGlow 560 e fotografados com um confocal de varredura a laser invertido cobrindo toda a espessura da dobra da barbatana caudal em um intervalo de tempo de 1 min por quadro (...

A premissa central do método de laminação PET envolve a redução de custos e a minimização das barreiras técnicas à entrada em comparação com os meios tradicionais de criação de dispositivos microfluídicos, como litografia suave ou moldagem PDMS. Como tal, as únicas etapas críticas neste protocolo são o alinhamento preciso das camadas de PET durante a laminação e a impermeabilização das bordas do dispositivo após a construção. Todas as outras partes do método pode...

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O trabalho foi apoiado por financiamento de pesquisa do National Institutes of Health (R35GM119787 to QD). Este trabalho é baseado em esforços apoiados pelo EMBRIO Institute, contrato NSF # 2120200, um Instituto de Integração de Biologia da National Science Foundation (NSF). A imagem confocal foi realizada no Purdue Imaging Facility. Agradecemos ao Dr. Guangjun Zhang (Purdue University) por fornecer a linha Tg (UAS: GCaMP6f). Agradecemos ao Dr. David Tobin (Duke University) por fornecer a linha (cdh1-tdtomato)xt18.