Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

Une méthode innovante de fabrication de dispositifs microfluidiques à l’aide de la stratification en polyéthylène téréphtalate (PET) réduit considérablement le coût et la complexité du piégeage et de l’imagerie de plusieurs embryons de poisson-zèbre vivants.

Les embryons de poisson-zèbre sont transparents et conviennent donc particulièrement à l’imagerie intravitale non invasive de processus fondamentaux, tels que la cicatrisation des plaies et la migration des cellules immunitaires. Les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour le piégeage afin de soutenir l’imagerie à long terme d’organismes multicellulaires, y compris le poisson zèbre. Cependant, la fabrication de ces dispositifs à l’aide de la lithographie douce nécessite des installations spécialisées et des compétences en impression 3D, qui peuvent ne pas être accessibles à tous les laboratoires. Notre adaptation d’une méthode de stratification du polyéthylène téréphtalate à faible coût précédemment développée pour la construction de dispositifs microfluidiques augmente l’accessibilité en permettant la conception, la fabrication et l’itération pour une fraction de l’investissement technique des techniques conventionnelles. Nous utilisons un appareil fabriqué avec cette méthode, l’assistant rotatif pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure (RADISH), pour permettre le traitement médicamenteux, les blessures manuelles et l’imagerie à long terme d’un maximum de quatre embryons dans le même champ de vision. Grâce à cette nouvelle conception, nous réussissons à capturer les caractéristiques morphologiques grossières du signal calcique autour de l’ablation laser et des plaies de transsection manuelle pour plusieurs embryons dans les 2 heures suivant immédiatement la blessure, ainsi que le recrutement des neutrophiles sur le bord de la plaie pendant 24 h.

La capacité de réagir adéquatement aux dommages est essentielle à la survie de chaque organisme à toutes les échelles, d’une seule cellule à plusieurs tissus. La blessure et ses réponses associées, telles que le recrutement de phagocytes dans les zones endommagées¹, sont donc des sujets importants en biologie cellulaire et tissulaire. Les plaies sont détectées immédiatement après la rupture de la barrière tissulaire, provoquant une réponse de gradient tissulaire impliquant une contraction de la plaie ^2,3 qui coordonne la cicatrisation de la plaie et la repousse ultérieure⁴. En raison de la nature mécanique de cette contraction, les outils utilisés lors de l’expérimentation ne doivent pas entraver physiquement le mouvement des cellules à proximité du site de la lésion.

Les embryons de poisson-zèbre sont un excellent modèle pour étudier le développement et les maladies, y compris la réponse des blessures des vertébrés, en raison de leur facilité d’entretien, de leur traçabilité génétique et de leur transparence optique ^5,6. Cependant, l’immobilisation de l’ensemble de l’organisme pendant une période prolongée est nécessaire pour étudier le comportement à long terme des cellules proches d’un site de lésion. L’intégration d’embryons dans de l’agarose à bas point de fusion est suffisante pour l’imagerie à court terme des tissus non blessés. Cependant, la matrice de gel environnante limite la contraction et le relâchement des plaies et entrave la croissance des embryons en développement au fil du temps ^7,8,9.

Les dispositifs microfluidiques peuvent immobiliser les embryons de poisson-zèbre à différents stades de développement 10,11,12,13,14,15,16, et certains, comme le zWEDGI 7, permettent des blessures manuelles. Cependant, il existe plusieurs inconvénients aux conceptions d’appareils disponibles. Par exemple, de nombreux appareils imprimés directement sur du plastique sont incompatibles avec l’imagerie sur des systèmes de microscope inversé en raison de leur faible transparence optique. De plus, les canaux parallèles permettent une imagerie multipositionnelle^10,11, mais le mouvement physique de la platine du microscope introduit un décalage dans l’acquisition de l’image. Il est difficile d’itérer et d’optimiser à plusieurs reprises pour résoudre ces problèmes si l’on considère l’investissement financier et technique requis pour chaque nouvelle conception, en particulier pour les méthodes actuelles de fabrication de dispositifs utilisant la lithographie douce au polydiméthylsiloxane (PDMS). La toute première étape, la création d’un moule maître, nécessite souvent la connaissance d’un logiciel de modélisation 3D, l’accès à des équipements de fabrication spécialisés et (selon le matériau utilisé) un traitement anti-adhérence supplémentaire tel que la silanisation avant même que le moule ne soit utilisé. Le durcissement du PDMS une fois coulé prend au moins une heure à haute température, et généralement, doit être effectué sous vide ou avec une pince pour de meilleurs résultats, souvent dans une salle blanche ^7,17,18. Comme en biologie du développement, ces coûts peuvent rapidement s’avérer prohibitifs pour des expériences nécessitant de nombreux environnements microfluidiques uniques sur plusieurs modèles.

Parmi les matériaux de construction alternatifs disponibles, le polyéthylène téréphtalate (PET) est durable, non toxique et facile à manipuler. Les feuilles de PET sont des pochettes de laminage en plastique largement disponibles dans la plupart des magasins de fournitures de bureau, avec un adhésif activé thermiquement pré-appliqué (généralement de l’éthylène-acétate de vinyle). En façonnant ces feuilles de PET à l’aide de découpeuses artisanales disponibles dans le commerce (c’est-à-dire des traceurs de découpe contrôlés par ordinateur conçus pour les bricoleurs amateurs) et en collant les couches les unes aux autres à l’aide d’un équipement de laminage thermique standard, un large éventail de conceptions potentielles peut être rapidement généré et itéré. Nous avons donc adapté une méthode de conception et de construction précédemment décrite impliquant du PET¹⁸ empilé pour créer le Rotational Assistant pour la Danio Imaging of Subsequent Hailing (RADISH) (Figure 1A,B). Une disposition rotative de plusieurs canaux de retenue en forme de coin optimise la proximité tout en laissant de la place pour la transsection manuelle de la nageoire caudale, permettant l’imagerie immédiatement après la blessure et l’imagerie simultanée à long terme de plusieurs embryons de poisson-zèbre blessés dans le même champ de vision. De plus, cette méthode de construction réduit considérablement les coûts d’investissement initiaux et le temps nécessaire à la construction du dispositif tout en maintenant la réutilisabilité.

Cette étude a utilisé des embryons 3 jours après la fécondation (dpf), mais peut être conçue pour utiliser de 2 à 14 embryons dpf. L’expérience du poisson-zèbre a été menée selon les normes internationalement acceptées. Le protocole de soin et d’utilisation des animaux a été approuvé par le Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), conformément aux lignes directrices pour l’utilisation du poisson-zèbre dans le programme de recherche intra-muros des NIH (numéro de protocole : 1401001018).

1. Assemblage du dispositif microfluidique PET

REMARQUE : Toute partie de ce protocole peut être interrompue à tout moment, à l’exception des étapes 1.8 et 1.9, qui sont sensibles au temps de séchage du cyanoacrylate.

1. Concevez le motif de l’appareil dans le logiciel de votre choix (par exemple, Adobe Illustrator, Figure 1A). En fonction de l’âge et de la taille de l’embryon, ajustez la largeur du canal et la taille de la chambre d’imagerie centrale pour un meilleur ajustement.
   1. Enregistrez chaque calque sous la forme d’un fichier image individuel aux dimensions identiques. Nommez chaque fichier de manière à ce que l’épaisseur de la tôle à utiliser et l’ordre d’assemblage soient évidents.
2. Initialisez la machine de découpe selon les instructions du fabricant.
3. Téléchargez chaque motif conçu dans le logiciel de conception pour la découpe.
   1. Dans l’espace de travail de conception, sélectionnez les conceptions nouvellement téléchargées. Regroupez les motifs destinés à la même épaisseur de feuille de PET dans la même coupe (figure 2A). Si nécessaire, réajustez la taille des motifs dans le logiciel de conception aux dimensions correctes.
   2. Confirmez le nombre et le type de motifs dans la coupe, puis sélectionnez le matériau coupé.
      REMARQUE : Les feuilles de PET peuvent ne pas être un choix de matériau dans le logiciel de conception, y compris sous des noms tels que « pochette de plastification en plastique ». Tout matériau d’épaisseur et de texture similaires (par exemple, des feuilles transparentes ou du vinyle non adhésif) peut être sélectionné à la place.
   3. Fixez les feuilles de PET sur le tapis de découpe, en appuyant fermement pour éliminer les bulles d’air, et chargez le tapis dans la machine de découpe. Suivez les instructions à l’écran pour demander à la machine de découpe de commencer la coupe.
   4. Retirez les coupes finies du tapis de découpe. Si nécessaire, ajustez les motifs de coupe à l’aide d’un couteau artisanal ou d’une lame de scalpel.
      REMARQUE : Les fichiers image utilisés pour créer la conception RADISH (Figure 1A) peuvent être téléchargés aux formats de fichier vectoriel et PNG (Fichier supplémentaire 1). Si la machine de découpe soulève, déchire ou ne parvient pas à couper proprement la feuille de PET, envisagez de remplacer le tapis de découpe.
4. Alignez les couches sur du verre lamelle, sans aide ou avec des marques de repérage prédécoupées. Si plusieurs couches peuvent être fixées ensemble avant le laminage, alignez-les simultanément.
5. Fixez les couches avec du ruban adhésif de bureau pour éviter de les déplacer pendant le laminage (Figure 2B). En fonction de la taille de l’appareil et de la capacité de la plastifieuse, montez les petits motifs sur un support plus grand avec plus de ruban adhésif pour éviter de coincer ou d’obstruer l’alimentation de la plastifieuse (Figure 2C).
   REMARQUE : Le support utilisé dans le laminage n’est PAS le même que le tapis de découpe et sert principalement à fournir une traction pour la plastifieuse. Tout matériau résistant à la chaleur d’une épaisseur négligeable fonctionnera comme support (y compris, mais sans s’y limiter, le papier cartonné, le papier de bureau plié ou une feuille de PET plus grande).
6. Allumez la plastifieuse et plastifiez selon les instructions du fabricant. Retirez le ruban adhésif de bureau avant d’aligner la couche suivante (Figure 2D).
7. Répétez les étapes 1.4 à 1.6 jusqu’à ce que toutes les couches aient été respectées.
8. Fixez l’appareil à une parabole de 35 mm percée d’un trou de 3/4" à l’aide de colle cyanoacrylate (Figure 2E,F). Ajustez la forme et le type de la boîte en fonction des besoins expérimentaux (par exemple, tout récipient suffisamment grand pour accueillir l’appareil - un puits dans une plaque à 24 puits ou une boîte de Pétri plus grande). Utilisez suffisamment de colle pour sceller complètement l’appareil sur le plat sans l’inonder.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de fixer l’appareil à un plat de maintien pour le fonctionnement de l’appareil. ATTENTION : Le cyanoacrylate lie la peau et les yeux en quelques secondes et irrite le système respiratoire, les yeux et la peau. Portez une protection pour les mains et les yeux et travaillez dans un endroit bien ventilé.
9. Imperméabilisez le stratifié PET en enduissant soigneusement les bords extérieurs de l’appareil avec de la colle cyanoacrylate (Figure 2F). Utilisez suffisamment de colle pour couvrir entièrement les bords extérieurs. Laissez la colle durcir pendant au moins 2 h avant de l’utiliser.
   REMARQUE : Assurez-vous d’un espace suffisant pour que les vapeurs de cyanoacrylate s’évacuent. L’accumulation de fumées peut provoquer le dépôt de cyanoacrylate sur l’appareil, obscurcissant ainsi les matériaux optiquement transparents.

2. Positionnement des embryons dans le RADISH et préparation à l’imagerie

1. Élever des embryons de poisson-zèbre dans le milieu d’élevage d’embryons standard E3¹⁹. Si nécessaire, déchorionner les embryons au moins 1 h avant l’imagerie pour leur permettre de s’aplatir. Cette expérience a utilisé des embryons à 3 dpf, mais les embryons peuvent avoir jusqu’à 14 dpf (figure 1E).
2. Colorez ou traitez les embryons selon les besoins expérimentaux.
   REMARQUE : Dans ces expériences, les membranes cellulaires de la couche épithéliale externe ont été colorées le cas échéant par incubation avec 100 nM de MemGlow 560.
3. Anesthésier les embryons à l’aide de 164 mg/L de MS-222²⁰.
   REMARQUE : La concentration exacte et l’anesthésique utilisés peuvent être ajustés selon les préférences de l’expérimentateur. La concentration anesthésique peut être réduite pour permettre un développement réussi lors des images à long terme (voir étape 4.1).
4. Remplissez le récipient contenant l’appareil monté avec 5 mL de E3 contenant 164 mg/L de MS-222.
5. À l’aide d’une pipette de transfert, déposez un embryon anesthésié dans chaque chambre de maintien du dispositif. Assurez-vous que les embryons restent immergés dans le liquide pendant toute la durée de l’imagerie.
   REMARQUE : Le modèle RADISH peut immobiliser 1 à 4 embryons.
6. À l’aide d’une boucle de cheveux, orientez les embryons de manière à ce que la queue de l’embryon dépasse dans la chambre d’imagerie centrale et que le jaune soit solidement immobilisé dans le canal cunéiforme (figure 1C).
   REMARQUE : L’orientation des embryons peut être effectuée sous un stéréomicroscope pour faciliter la manipulation.
7. Si vous le souhaitez, fixez la tête de l’embryon en ajoutant 1,5 % d’agarose à bas point de fusion dans la chambre de rétention à l’aide d’une micropipette.
8. Déplacez l’appareil contenant les embryons vers le système d’imagerie de votre choix pour commencer l’imagerie.

3. Imagerie des transitoires calciques après une blessure

REMARQUE : Cette section et la section 4 sont facultatives et fournies à titre d’exemples d’expériences potentielles.

1. Sélectionnez le système et l’objectif appropriés pour l’imagerie.
   REMARQUE : Ici, un confocal à balayage laser inversé a été équipé d’un objectif 20x.
2. Ajustez la mise au point de l’échantillon et les paramètres d’imagerie (par exemple, puissance laser : 5, gain : 90, taille du sténopé : 2 AU, temps d’exposition [vitesse de balayage : 1 image/s]) pour un rapport signal/bruit et une vitesse d’acquisition optimaux.
   REMARQUE : Il est recommandé de préfocaliser les échantillons et d’ajuster les paramètres de chaque canal sur le système d’imagerie du choix avant la blessure afin de réduire le décalage entre la formation de la plaie et l’acquisition de l’image.
3. Blessure d’un embryon Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821,22.
   1. Pour blesser l’embryon par transsection manuelle, appliquez une pression avec une lame de scalpel sur le tissu de la nageoire caudale à l’extrémité de la notocorde sous un stéréomicroscope (Vidéo 1), puis remettez le dispositif sur la scène.
      ATTENTION : L’application d’une pression excessive avec la lame du scalpel peut fissurer le verre sous-jacent. Si le verre se fissure, jetez l’appareil et redémarrez à partir de l’étape 1.2.
   2. Pour blesser l’embryon par stimulation laser, définissez une région d’intérêt (ROI) près du bord du pli de la nageoire caudale et stimulez en fonction de la puissance laser disponible.
      REMARQUE : Ici, une puissance laser de 2,4 W pendant 30 s à 800 nm était suffisante pour induire une blessure de pleine épaisseur.
4. Image à température ambiante à l’aide des canaux GFP (excitation 488 nm, émission 510 nm) et RFP (excitation 561 nm, émission 610 nm) en utilisant un intervalle d’image de 1 min pour un total de 1 h.
5. (Facultatif) : Si nécessaire, libérez les embryons pour le prélèvement après imagerie par aspiration douce près de la tête à l’aide d’une pipette de transfert ou en faisant tourner la boîte.

4. Imagerie du recrutement des neutrophiles après une blessure

1. Au moins 1 h avant l’imagerie, transférez les embryons dans E3 contenant la moitié de la concentration standard d’anesthésique, dans ce cas, 82 mg/L MS-222.
2. Sélectionnez l’objectif approprié pour l’imagerie (ici, un confocal à balayage laser inversé équipé d’un objectif 10x).
3. Ajustez la mise au point de l’échantillon et les paramètres d’imagerie (par exemple, puissance laser : 5, gain : 90, taille du sténopé : 2 AU, temps d’exposition [vitesse de balayage : 0,5 image/s])) pour un rapport signal/bruit et une vitesse d’acquisition optimaux.
   REMARQUE : Il est recommandé de préfocaliser les échantillons et d’ajuster les paramètres de chaque canal sur le système d’imagerie du choix avant la blessure afin de réduire le décalage entre la formation de la plaie et l’acquisition de l’image.
4. Enroulez quatre embryons de Tol2(mpx :Dendra2)²³ par section manuelle en appliquant une pression avec une lame de scalpel sur le tissu de la nageoire caudale sous un stéréomicroscope, puis remettez l’appareil sur la scène.
5. Capturez l’image sur le canal GFP (excitation 488 nm, émission 510 nm) à température ambiante en utilisant un intervalle d’image de 5 minutes pendant 24 h.
6. Si nécessaire, libérez les embryons pour le prélèvement après l’imagerie par aspiration douce près de la tête à l’aide d’une pipette de transfert ou en faisant tourner la boîte.

Pour comparer la qualité d’image produite par un confocal à balayage laser avec et sans l’aide du RADISH, des embryons exprimant le biocapteur calcique intensiométrique GCaMP6f^22,24 dans la couche épithéliale externe ont été colorés à l’aide de MemGlow 560 et imagés avec un confocal à balayage laser inversé couvrant toute l’épaisseur du pli de la nageoire caudale à un intervalle de temps de 1 min par image (...

Le principe de base de la méthode de laminage PET implique la réduction des coûts et la minimisation des barrières techniques à l’entrée par rapport aux méthodes traditionnelles de création de dispositifs microfluidiques, telles que la lithographie douce ou le moulage PDMS. En tant que tel, les seules étapes critiques de ce protocole sont l’alignement précis des couches de PET lors du laminage et l’imperméabilisation des bords de l’appareil après la construction. Tout...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les travaux ont été soutenus par des fonds de recherche des National Institutes of Health (R35GM119787 to QD). Ce travail est basé sur les efforts soutenus par l’Institut EMBRIO, contrat NSF #2120200, un institut d’intégration de la biologie de la National Science Foundation (NSF). L’imagerie confocale a été réalisée à l’installation d’imagerie de Purdue. Nous remercions le Dr Guangjun Zhang (Université Purdue) d’avoir fourni la ligne Tg(UAS :GCaMP6f). Nous remercions le Dr David Tobin (Université Duke) d’avoir fourni la lignée (cdh1-tdtomato)xt18.