Diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra

Un método innovador para fabricar dispositivos microfluídicos utilizando la laminación de tereftalato de polietileno (PET) reduce significativamente el costo y la complejidad de atrapar e obtener imágenes de múltiples embriones vivos de pez cebra.

Los embriones de pez cebra son transparentes y, por lo tanto, son especialmente adecuados para la obtención de imágenes intravitales no invasivas de procesos fundamentales, como la cicatrización de heridas y la migración de células inmunitarias. Los dispositivos microfluídicos se utilizan para el atrapamiento para respaldar la obtención de imágenes a largo plazo de organismos multicelulares, incluido el pez cebra. Sin embargo, la fabricación de estos dispositivos mediante litografía blanda requiere instalaciones especializadas y competencia en impresión 3D, que puede no ser accesible para todos los laboratorios. Nuestra adaptación de un método de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo desarrollado anteriormente para construir dispositivos microfluídicos aumenta la accesibilidad al permitir el diseño, la fabricación y la iteración por una fracción de la inversión técnica de las técnicas convencionales. Utilizamos un dispositivo fabricado con este método, el Asistente Rotacional para la Imagen Danio de la Curación Posterior (RADISH), para acomodar el tratamiento farmacológico, las heridas manuales y la obtención de imágenes a largo plazo de hasta cuatro embriones en el mismo campo de visión. Con este nuevo diseño, capturamos con éxito las características morfológicas macroscópicas de la señal de calcio alrededor de la ablación con láser y las heridas de transección manual para múltiples embriones en las 2 h inmediatamente posteriores a la lesión, así como el reclutamiento de neutrófilos al borde de la herida durante 24 h.

La capacidad de responder adecuadamente a las lesiones es fundamental para la supervivencia de todos los organismos a todas las escalas, desde una sola célula hasta múltiples tejidos. Las heridas y sus respuestas asociadas, como el reclutamiento de fagocitos a las áreas dañadas¹ son, por lo tanto, temas importantes en biología celular y tisular. Las heridas se detectan inmediatamente después de que se rompe la barrera tisular, lo que provoca una respuesta de gradiente tisular que implica la contracción de la herida ^2,3 que coordina la cicatrización de la herida y su posterior recrecimiento⁴. Debido a la naturaleza mecánica de esta contracción, las herramientas utilizadas durante la experimentación no deben impedir físicamente el movimiento de las células cerca del sitio de la lesión.

Los embriones de pez cebra son un excelente modelo para estudiar el desarrollo y la enfermedad, incluida la respuesta de los vertebrados a las heridas, debido a su facilidad de cuidado, trazabilidad genética y transparencia óptica ^5,6. Sin embargo, es necesario inmovilizar todo el organismo durante un período prolongado para estudiar el comportamiento a largo plazo de las células cerca de un sitio de lesión. La inclusión de embriones en agarosa de bajo punto de fusión es suficiente para obtener imágenes a corto plazo del tejido no herido. Sin embargo, la matriz de gel circundante restringe la contracción y relajación de las heridas e impide el crecimiento de los embriones en desarrollo con el tiempo ^7,8,9.

Los dispositivos de microfluídica pueden inmovilizar embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo 10,11,12,13,14,15,16, y algunos, como el zWEDGI 7, admiten heridas manuales. Sin embargo, hay varios inconvenientes en los diseños de dispositivos disponibles. Por ejemplo, muchos dispositivos impresos directamente en plástico son incompatibles con la obtención de imágenes en sistemas de microscopio invertido debido a la escasa transparencia óptica. Además, los canales paralelos permiten la obtención de imágenes multiposicionales^10,11, pero el movimiento físico de la platina del microscopio introduce un retraso en la adquisición de imágenes. La iteración repetida y la optimización para resolver estos problemas son difíciles cuando se considera la inversión financiera y técnica requerida para cada nuevo diseño, especialmente para los métodos actuales de fabricación de dispositivos que utilizan litografía blanda de polidimetilsiloxano (PDMS). El primer paso, la creación de un molde maestro, a menudo requiere conocimiento de software de modelado 3D, acceso a equipos de fabricación especializados y (dependiendo del material utilizado) un tratamiento antiadherente adicional, como la silanización, antes de que se use el molde. El curado del PDMS una vez vertido toma al menos una hora a altas temperaturas y, generalmente, debe realizarse al vacío o con una pinza para obtener mejores resultados, a menudo en una sala limpia ^7,17,18. Al igual que en la biología del desarrollo, estos costos pueden resultar rápidamente prohibitivos para experimentos que requieren muchos entornos microfluídicos únicos en múltiples modelos.

De los materiales de construcción alternativos disponibles, el tereftalato de polietileno (PET) es duradero, no tóxico y fácil de manipular. Las láminas de PET son bolsas de laminación de plástico ampliamente disponibles que se venden en la mayoría de las tiendas de suministros de oficina, con adhesivo activado térmicamente preaplicado (generalmente etileno acetato de vinilo). Al dar forma a estas láminas de PET utilizando cortadores artesanales disponibles en el mercado (es decir, plotters de corte controlados por computadora diseñados para artesanos domésticos) y adherir las capas entre sí utilizando equipos de laminación térmica estándar, se puede generar e iterar rápidamente una amplia gama de diseños potenciales. Por lo tanto, hemos adaptado un método de diseño y construcción descrito anteriormente que involucra PET¹⁸ apilado para crear el Asistente Rotacional para el Danio Imaging de Subsultent Healing (RADISH) (Figura 1A, B). Una disposición rotacional de varios canales de restricción aproximadamente en forma de cuña optimiza la proximidad al tiempo que permite espacio para la transección manual de la aleta caudal, lo que permite la obtención de imágenes inmediatamente después del herido y la obtención simultánea de imágenes a largo plazo de múltiples embriones de pez cebra heridos dentro del mismo campo de visión. Además, este método de construcción reduce drásticamente los costos de capital iniciales y el tiempo requerido para la construcción del dispositivo, al tiempo que mantiene la reutilización.

Este estudio utilizó embriones de 3 días después de la fertilización (dpf), pero se puede diseñar para usar embriones de 2 a 14 dpf. El experimento del pez cebra se llevó a cabo según los estándares internacionalmente aceptados. El Protocolo de Cuidado y Uso de Animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Purdue (PACUC), adhiriéndose a las Pautas para el uso de pez cebra en el Programa de Investigación Intramuros de los NIH (número de protocolo: 1401001018).

1. Montaje del dispositivo de microfluídica PET

NOTA: Cualquier parte de este protocolo puede detenerse en cualquier momento, excepto los pasos 1.8 y 1.9, que son sensibles al tiempo de secado del cianocrilato.

1. Diseñe el patrón para el dispositivo en el software de su elección (por ejemplo, Adobe Illustrator, Figura 1A). Dependiendo de la edad y el tamaño del embrión, ajuste el ancho del canal y el tamaño de la cámara central de imágenes para un mejor ajuste.
   1. Guarde cada capa como un archivo de imagen individual con dimensiones idénticas. Asigne un nombre a cada archivo de manera que el grosor de la hoja que se utilizará y el orden de montaje sean evidentes.
2. Inicialice la máquina de corte de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Cargue cada patrón diseñado en el software de diseño para cortar.
   1. En el espacio de trabajo de diseño, seleccione los diseños recién cargados. Agrupe los patrones destinados al mismo grosor de lámina de PET en el mismo corte (Figura 2A). Si es necesario, reajuste el tamaño de los patrones en el software de diseño a las dimensiones correctas.
   2. Confirme el número y el tipo de patrones en el corte y, a continuación, seleccione el material de corte.
      NOTA: Es posible que las láminas de PET no sean una opción de material en el software de diseño, incluso con nombres como "bolsa de laminación de plástico". En su lugar, se puede seleccionar cualquier material de grosor y textura similares (por ejemplo, láminas de transparencia o vinilo no adhesivo).
   3. Fije las láminas de PET a la alfombrilla de corte, presionando firmemente para eliminar las burbujas de aire, y cargue la alfombrilla en la máquina de corte. Siga las instrucciones en pantalla para indicar a la máquina de corte que comience el corte.
   4. Retire los cortes terminados del tapete de corte. Si es necesario, ajuste los patrones de corte con un cuchillo artesanal o una hoja de bisturí.
      NOTA: Los archivos de imagen utilizados para crear el diseño de RADISH (Figura 1A) están disponibles para su descarga como formatos de archivo vectorial y PNG (Archivo complementario 1). Si la máquina de corte levanta, rasga o no corta limpiamente la lámina de PET, considere reemplazar el tapete de corte.
4. Alinee las capas en el vidrio cubreobjetos, sin ayuda o con marcas de registro precortadas. Si se pueden unir varias capas antes de la laminación, alinéelas simultáneamente.
5. Asegure las capas con cinta de oficina para evitar que se muevan durante el laminado (Figura 2B). Dependiendo del tamaño del dispositivo y la capacidad de la laminadora, monte los diseños pequeños en un respaldo más grande con más cinta para evitar atascos u obstrucciones en la alimentación de la laminadora (Figura 2C).
   NOTA: El soporte utilizado en la laminación NO es el mismo que la alfombrilla de corte, y sirve principalmente para proporcionar tracción a la laminadora. Cualquier material resistente al calor de grosor insignificante funcionará como soporte (incluidos, entre otros, cartulina, papel de oficina doblado o una hoja de PET más grande).
6. Encienda la laminadora y el laminado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Retire la cinta de oficina antes de alinear la siguiente capa (Figura 2D).
7. Repita los pasos 1.4 a 1.6 hasta que se hayan adherido todas las capas.
8. Asegure el dispositivo a un plato de 35 mm perforado con un orificio de 3/4" con pegamento de cianoacrilato (Figura 2E, F). Ajuste la forma y el tipo de plato de acuerdo con las necesidades experimentales (por ejemplo, cualquier recipiente lo suficientemente grande como para acomodar el dispositivo: un pozo en una placa de 24 pocillos o una placa de Petri más grande). Use suficiente pegamento para sellar el dispositivo completamente al plato sin inundarlo.
   NOTA: No es necesario asegurar el dispositivo a un plato de sujeción para el funcionamiento del dispositivo. PRECAUCIÓN: El cianoacrilato adhiere la piel y los ojos en segundos e irrita el sistema respiratorio, los ojos y la piel. Use protección para las manos y los ojos y trabaje en un área bien ventilada.
9. Impermeabilice el laminado PET cubriendo completamente los bordes exteriores del dispositivo con pegamento de cianoacrilato (Figura 2F). Use suficiente pegamento para cubrir completamente los bordes exteriores. Deje que el pegamento se cure durante al menos 2 horas antes de usarlo.
   NOTA: Asegúrese de que haya un espacio adecuado para que los vapores de cianoacrilato se ventilen. La acumulación de humos puede hacer que el cianoacrilato se deposite en el dispositivo, oscureciendo el material ópticamente transparente.

2. Posicionamiento de los embriones dentro del RÁBANO y preparación para la obtención de imágenes

1. Cría embriones de pez cebra en el medio estándar de cría de embriones E3¹⁹. Si es necesario, descorionar los embriones al menos 1 h antes de la toma de imágenes para permitir que se aplanen. En este experimento se utilizaron embriones a 3 dpf, pero los embriones pueden tener hasta 14 dpf (Figura 1E).
2. Teñir o tratar los embriones de acuerdo con las necesidades experimentales.
   NOTA: En estos experimentos, las membranas celulares de la capa epitelial externa se tiñeron donde correspondía incubando con MemGlow 560 de 100 nM.
3. Anestesiar embriones con 164 mg/L MS-222²⁰.
   NOTA: La concentración exacta y el anestésico utilizado pueden ajustarse de acuerdo con las preferencias del experimentador. La concentración del anestésico puede reducirse para permitir un revelado exitoso durante las imágenes a largo plazo (ver paso 4.1).
4. Llene el plato de retención que contiene el dispositivo montado con 5 mL de E3 que contenga 164 mg/L MS-222.
5. Con una pipeta de transferencia, deposite un embrión anestesiado en cada cámara de retención del dispositivo. Asegúrese de que los embriones permanezcan sumergidos en líquido durante la duración de la toma de imágenes.
   NOTA: El diseño de rábano puede inmovilizar de 1 a 4 embriones.
6. Usando un lazo de cabello, oriente los embriones de manera que la cola del embrión sobresalga en la cámara central de imágenes y la yema quede inmovilizada de forma segura en el canal en forma de cuña (Figura 1C).
   NOTA: La orientación de los embriones se puede realizar bajo un microscopio estereoscópico para facilitar la manipulación.
7. Si lo desea, asegure la cabeza del embrión añadiendo un 1,5% de agarosa de bajo punto de fusión en la cámara de retención con una micropipeta.
8. Mueva el dispositivo con embriones al sistema de diagnóstico por imágenes de su elección para comenzar la toma de imágenes.

3. Imágenes de transitorios de calcio después de la herida

NOTA: Esta sección y la sección 4 son opcionales y se proporcionan como posibles experimentos de muestra.

1. Seleccione el sistema y el objetivo adecuados para la obtención de imágenes.
   NOTA: Aquí, un confocal de escaneo láser invertido estaba equipado con un objetivo 20x.
2. Ajuste el enfoque de la muestra y los parámetros de imagen (p. ej., potencia del láser: 5, ganancia: 90, tamaño del agujero de alfiler: 2 UA, tiempo de exposición [velocidad de escaneo: 1 fotograma/s]) para obtener una relación señal-ruido y una velocidad de adquisición óptimas.
   NOTA: Se recomienda que las muestras estén preenfocadas y que los parámetros de cada canal en el sistema de imágenes de elección se ajusten antes de la herida para reducir el retraso entre la formación de la herida y la adquisición de la imagen.
3. Herida a Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821,22 embrión.
   1. Para herir el embrión a través de la transección manual, aplique presión con una hoja de bisturí a través del tejido de la aleta caudal en la punta de la notocorda bajo un microscopio estereoscópico (Video 1), luego regrese el dispositivo a la etapa.
      PRECAUCIÓN: La aplicación de una presión excesiva con la hoja del bisturí puede agrietar el vidrio subyacente. Si el vidrio se agrieta, deseche el dispositivo y reinicie desde el paso 1.2.
   2. Para enrollar el embrión mediante estimulación láser, defina una región de interés (ROI) cerca del borde del pliegue de la aleta caudal y estimule de acuerdo con la potencia láser disponible.
      NOTA: En este caso, una potencia láser de 2,4 W durante 30 s a 800 nm fue suficiente para inducir una herida de espesor completo.
4. Imagen a temperatura ambiente utilizando canales GFP (excitación 488 nm, emisión 510 nm) y RFP (excitación 561 nm, emisión 610 nm) utilizando un intervalo de fotograma de 1 min para un total de 1 h.
5. (Opcional): Si es necesario, libere los embriones para su recuperación después de la obtención de imágenes mediante una succión suave cerca de la cabeza utilizando una pipeta de transferencia o girando el plato.

4. Imagen del reclutamiento de neutrófilos después de la herida

1. Al menos 1 h antes de la toma de imágenes, transfiera los embriones a E3 que contengan la mitad de la concentración estándar de anestésico, en este caso, 82 mg/L MS-222.
2. Seleccione el objetivo apropiado para la obtención de imágenes (en este caso, un confocal de escaneo láser invertido equipado con un objetivo 10x).
3. Ajuste el enfoque de la muestra y los parámetros de imagen (p. ej., potencia del láser: 5, ganancia: 90, tamaño del orificio: 2 UA, tiempo de exposición [velocidad de escaneo: 0,5 fotogramas/s])) para obtener una relación señal-ruido y una velocidad de adquisición óptimas.
   NOTA: Se recomienda que las muestras estén preenfocadas y que los parámetros de cada canal en el sistema de imágenes de elección se ajusten antes de la herida para reducir el retraso entre la formación de la herida y la adquisición de la imagen.
4. Enrolló cuatro embriones de Tol2(mpx:Dendra2)²³ mediante transección manual aplicando presión con una hoja de bisturí a través del tejido de la aleta caudal bajo un microscopio estereoscópico, y luego devolvió el dispositivo a la etapa.
5. Capture la imagen en el canal GFP (excitación de 488 nm, emisión de 510 nm) a temperatura ambiente utilizando un intervalo de fotogramas de 5 minutos durante 24 h.
6. Si es necesario, libere los embriones para su recuperación después de la obtención de imágenes mediante una succión suave cerca de la cabeza utilizando una pipeta de transferencia o girando el plato.

Para comparar la calidad de imagen producida por un confocal de escaneo láser con y sin la ayuda del RADISH, los embriones que expresan el biosensor de calcio intensivo GCaMP6f^22,24 en la capa epitelial externa se tiñeron con MemGlow 560 y se obtuvieron imágenes con un confocal de escaneo láser invertido que cubre todo el espesor del pliegue de la aleta caudal en un intervalo de tiempo de 1 minuto por fotograma (Video...

La premisa central del método de laminación de PET implica la reducción de costos y la minimización de las barreras técnicas de entrada en comparación con los medios tradicionales de creación de dispositivos microfluídicos, como la litografía blanda o el moldeo PDMS. Como tal, los únicos pasos críticos en este protocolo son la alineación precisa de las capas de PET durante la laminación y la impermeabilización de los bordes del dispositivo después de la construcción. Toda...

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El trabajo fue financiado por fondos de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (R35GM119787 a QD). Este trabajo se basa en los esfuerzos apoyados por el Instituto EMBRIO, contrato de la NSF # 2120200, un Instituto de Integración Biológica de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF). Las imágenes confocales se realizaron en el Centro de Imágenes de Purdue. Agradecemos al Dr. Guangjun Zhang (Universidad de Purdue) por proporcionar la línea Tg (UAS: GCaMP6f). Agradecemos al Dr. David Tobin (Universidad de Duke) por proporcionar la línea (cdh1-tdtomato)xt18.