Um modelo murino imaturo de obstrução ureteral unilateral reversível

O presente protocolo descreve um modelo passo a passo reprodutível de obstrução ureteral unilateral.

A obstrução ureteral unilateral (UUO) é uma causa comum de doença renal crônica (DRC), levando à progressão da fibrose intersticial renal e, por fim, resultando em danos renais irreversíveis. O alívio do UUO é crucial. Vários modelos animais de obstrução ureteral unilateral reversível (RUUO) foram estabelecidos na literatura, permitindo a observação de alterações estruturais e danos funcionais, além de simular alterações fisiológicas e fisiopatológicas após o alívio da obstrução ureteral. Neste estudo, foi estabelecido um modelo de obstrução reversível no ureter murino unilateral com tubo de silicone. Danos renais significativos foram observados antes do alívio da obstrução, com recuperação parcial observada posteriormente. Ao contrário do UUO, este modelo previne a hidronefrose progressiva, levando a resultados patológicos distintos. Este procedimento cirúrgico simples demonstra uma alta taxa de sucesso e é promissor como um modelo clássico para investigar nefropatia obstrutiva reversível e possíveis tratamentos para fibrose intersticial renal. Além disso, fornece uma plataforma prática para estudar os mecanismos de recuperação da nefropatia obstrutiva, regeneração de células renais e remodelação tecidual.

A obstrução uretral contribui significativamente para a fibrose intersticial renal e a doença renal crônica (DRC), podendo levar a danos estruturais irreversíveis e prejuízos funcionais no rim¹. Embora a obstrução ureteral unilateral (UUO) seja amplamente utilizada para estudar lesão renal e DRC, ela não replica com precisão os mecanismos de recuperação espontânea que ocorrem após a remoção de uma obstrução. O modelo UUO envolve a ligadura do ureter esquerdo com suturas, resultando em obstrução permanente, dilatação ureteral, hidronefrose, compressão do parênquima renal e afinamento cortical. O exame histológico geralmente revela dilatação tubular, necrose de células epiteliais tubulares e inflamação intersticial progressiva e fibrose². Este modelo investiga principalmente a fibrose intersticial renal e a perda irreversível da função renal devido à obstrução persistente.

No entanto, muitas doenças renais encontradas na prática clínica, como obstrução causada por cálculos ou tumores ureterais, são reversíveis. O modelo de obstrução ureteral unilateral reversível (RUUO) permite a restauração parcial da estrutura renal e da função do trato urinário, resolvendo a hidronefrose. A recuperação pode ser avaliada por meio de técnicas de imagem, exame histológico e análise de biomarcadores para quantificar a redução da lesão renal e fibrose³. Este modelo imita de perto a fase de recuperação da nefropatia obstrutiva em ambientes clínicos e é mais adequado do que o UUO para estudar processos-chave como inflamação, respostas imunes, regeneração celular e remodelação tecidual 4,5,6,7,8.

O modelo RUUO permite que os pesquisadores analisem o reparo e a regeneração renal após o alívio da lesão, abordando as limitações do UUO em estudos dinâmicos. Ao comparar diferentes pontos de tempo antes e depois da obstrução, os pesquisadores podem investigar as vias moleculares envolvidas na lesão e no reparo, incluindo inflamação, apoptose, fibrose e regeneração. Essa abordagem melhora a compreensão dos mecanismos de recuperação renal e identifica potenciais alvos terapêuticos 2,3,4,5,8,9,10. Embora a fibrose renal seja frequentemente considerada irreversível, as observações clínicas sugerem que o alívio precoce da obstrução durante os estágios iniciais da fibrose pode interromper ou mesmo reverter a progressão da doença. O modelo RUUO fornece uma plataforma experimental valiosa para investigar esse fenômeno¹¹.

Além disso, o modelo RUUO facilita o estudo da reversão da fibrose após o alívio da obstrução, oferecendo insights sobre os mecanismos de recuperação e possíveis terapias antifibróticas ^3,4. Consequentemente, este modelo é altamente prático para a pesquisa translacional. O objetivo principal deste modelo experimental é induzir nefropatia obstrutiva por meio de canulação ureteral, seguida de alívio padronizado em um ponto de tempo predefinido para garantir a consistência. Ele é otimizado para simplicidade, reprodutibilidade e segurança, tornando-o uma ferramenta eficaz para pesquisas experimentais.

Este estudo em animais aderiu às diretrizes da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Infantil da Universidade Médica de Chongqing. Um total de 27 ratos Sprague Dawley (SD) machos foram obtidos comercialmente e alojados no Centro de Animais de Laboratório do Hospital Infantil da Universidade Médica de Chongqing (SPF, número de licença: SYXK (Chongqing) 2007-0016). Os ratos foram mantidos em condições controladas de temperatura com ciclo claro/escuro de 12 horas e tiveram acesso ad libitum a comida e água.

O protocolo foi realizado em ratos machos SD com idade entre 6 e 8 semanas e é aplicável a ratos de todas as idades com ureteres bilaterais. Neste estudo, quinze ratos SD machos de 6 semanas de idade foram aleatoriamente divididos em três grupos: o grupo nativo (n = 5), o grupo UUO (n = 5) e o grupo RUUO (n = 5). Além disso, cinco ratos SD de 8 semanas de idade (n = 5) foram incluídos como um grupo controle adicional. Para estabelecer o modelo RUUO, foram utilizados 12 ratos, com 7 ratos adicionais adquiridos para contabilizar riscos potenciais, como mortalidade intra e pós-operatória, falhas cirúrgicas, obstrução incompleta e reversão malsucedida. Isso garantiu um mínimo de 5 ratos por grupo para análises subsequentes.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais para cuidados e uso de animais de laboratório. A equipe cirúrgica aderiu aos protocolos de equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo máscaras cirúrgicas, luvas e aventais. Instrumentos cirúrgicos estéreis foram usados para cada procedimento e foram autoclavados antes e após o uso para manter a esterilidade. Os resíduos, incluindo perfurocortantes e espécimes biológicos, foram descartados em conformidade com os protocolos de gerenciamento de resíduos perigosos para mitigar os riscos de contaminação e garantir a segurança.

1. Preparação de animais e instrumentos

1. Realize todos os procedimentos usando instrumentos estéreis (autoclavados) e consumíveis. Corte o tubo de silicone esterilizado (diâmetro interno: 1.5 mm, diâmetro externo: 2.5 mm) em segmentos de aproximadamente 1 cm. Faça uma incisão longitudinal ao longo de um lado da parede do tubo para uso posterior.
2. Anestesiar os ratos por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital (40 mg / kg) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme a anestesia adequada verificando a ausência de respostas reflexas, como o reflexo de retirada do pedal, ao beliscar o dedo do pé. Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia.
3. Depile o abdômen do rato do processo xifóide até a sínfise púbica e estenda bilateralmente até a linha média.
4. Posicione o rato em decúbito dorsal em uma almofada cirúrgica aquecida e prenda seus membros com cordas de borracha.
5. Cubra uma folha fenestrada estéril para manter um campo estéril. Prepare a pele com solução de iodopovidona. Faça uma incisão na pele na linha média ao longo do abdômen, estendendo-se da região subxifóide até logo abaixo do umbigo, para proporcionar exposição adequada dos rins e ureteres superiores.
6. Incisar os tecidos subcutâneos e a fáscia ao longo da linha média usando uma tesoura cirúrgica. Disseque a pele e os tecidos subjacentes meticulosamente, camada por camada, e exponha totalmente o espaço retroperitoneal usando uma pinça de tecido.

2. Cirurgia obstrutiva para obstrução ureteral unilateral reversível

1. Retraia o intestino para o lado direito da cavidade abdominal usando um cotonete estéril para facilitar a visualização direta do ureter esquerdo. Cubra o ureter com gaze embebida em solução salina para evitar a dessecação.
2. Disseque e mobilize o ureter esquerdo usando uma pinça microscópica, liberando aproximadamente 1,5 cm dos tecidos circundantes.
3. Coloque um tubo de silicone de 1 cm de comprimento (diâmetro interno: 1.5 mm, diâmetro externo: 2.5 mm) abaixo do ureter liberado. Use uma pinça para garantir o invólucro completo dentro do tubo.
4. Ligue o tubo de silicone e a porção média do ureter usando fio de seda 3-0 para induzir a obstrução ureteral. Evite força de ligadura excessiva. Puxe gradualmente o tubo de silicone ao longo do eixo longitudinal do ureter para garantir uma ligadura segura, mas sem deslizamento.
5. Reposicione o intestino dentro da cavidade peritoneal com cuidado, garantindo o alinhamento adequado sem tensão ou obstrução.
6. Suturar o músculo abdominal e as camadas fasciais usando uma sutura não absorvível 2-0 com uma agulha cortante curva de forma contínua para fornecer resistência à tração adequada. Feche a pele com uma sutura inabsorvível 4-0, garantindo alinhamento anatômico e tensão uniforme para promover a cicatrização e minimizar o risco de deiscência da ferida.
7. Desinfete o local da incisão com solução de iodopovidona. Permitir que os ratos recuperem em condições controladas a uma temperatura constante durante 7 dias.

3. Cirurgia de alívio da obstrução ureteral unilateral reversível

1. Preparar os animais e instrumentos necessários, garantindo uma configuração estéril para a reabertura abdominal e exposição total da cavidade abdominal.
2. Disseque o nó do tubo de silicone cuidadosamente usando uma lâmina de bisturi. Remova o tubo e irrigue a cavidade abdominal com solução salina normal para minimizar a adesão e o risco de infecção.
3. Reposicione o intestino e suture a incisão da parede abdominal em camadas usando suturas não absorvíveis 4-0. Esterilize o local da incisão com solução de iodopovidona. Coloque o rato em um ambiente de temperatura controlada por um período de recuperação pós-operatória de 7 dias.
4. No 14º dia de pós-operatório, anestesiar os ratos (seguindo o procedimento mencionado no passo 1.2) e coletar amostras renais seccionando-se transversalmente os rins em duas metades⁹.
5. Armazene metade em paraformaldeído a 4% para exame histopatológico e congele rapidamente a outra metade em nitrogênio líquido para armazenamento a -80 ° C para análise molecular subsequente. Colete amostras de sangue para análises bioquímicas.
6. Realizar a eutanásia via asfixia por CO₂ seguida de luxação cervical seguindo as diretrizes éticas.

4. Avaliações de acompanhamento

1. Acompanhe o peso corporal pós-RUUO para avaliar a recuperação geral. Compare as mudanças de peso com os grupos controle e UUO.
2. Meça o peso e o volume do rim para avaliar a recuperação renal.
3. Monitore os níveis de creatinina sérica (Scr) como um indicador de melhora da função renal⁹.
4. Injete azul de metileno na pelve renal para confirmar a permeabilidade ureteral. Observe o peristaltismo ureteral e a coloração para avaliar a recuperação pós-obstrução.
5. Realizar coloração H&E para avaliar a integridade tubular e a estrutura renal após RUUO ^8,10.
6. Realizar a coloração tricrômica de Masson para avaliar a regressão da fibrose intersticial renal ^8,10.
7. Compare os escores de dano renal ^3,8 entre os grupos UUO e RUUO para quantificar a recuperação tecidual.

Foram avaliados os efeitos da UUO e sua subsequente liberação (RUUO) sobre o peso corporal, peso renal, volume renal e níveis séricos de creatinina (Scr), conforme resumido na Tabela 1. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP), com n = 5 por grupo.

Às 6 semanas, o grupo nativo exibiu um peso corporal médio de 234 g ± 16 g, peso renal de 0,9107 g ± 0,0475 g e volume renal de 0,8962 cm³ ± 0,0502 cm³. Às 8 semanas...

Este modelo emprega um tubo de silicone para circundar o ureter, fornecendo suporte estrutural, seguido de ligadura com um fio de seda para induzir a obstrução ureteral completa por compressão. Após sete dias, a ligadura e o tubo de silicone são removidos para facilitar a descompressão renal e a restauração da integridade e funcionalidade do trato urinário.

Os tubos de silicone, fabricados a partir de elastômeros de silicone, oferecem excelente flexi...

Nenhum.

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Inovação Juvenil em Medicina do Futuro, Universidade Médica de Chongqing (W0056), Projeto Conjunto de Inovação Tecnológica e Desenvolvimento de Aplicativos da MTC de Ciência e Saúde de Chongqing (2020ZY023877).