Un modèle murin immature d’obstruction urétérale unilatérale réversible

Le présent protocole décrit un modèle reproductible étape par étape de l’obstruction urétérale unilatérale.

L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) est une cause fréquente d’insuffisance rénale chronique (IRC), entraînant la progression de la fibrose interstitielle rénale et entraînant finalement des lésions rénales irréversibles. L’atténuation de l’UUO est cruciale. Plusieurs modèles animaux d’obstruction urétérale unilatérale réversible (RUUO) ont été établis dans la littérature, permettant d’observer les changements structurels et les dommages fonctionnels tout en simulant les changements physiologiques et physiopathologiques suite au soulagement de l’obstruction urétérale. Dans cette étude, un modèle d’obstruction réversible a été établi dans l’uretère murin unilatéral à l’aide d’un tube en silicone. Des lésions rénales importantes ont été observées avant le soulagement de l’obstruction, avec une récupération partielle notée par la suite. Contrairement à l’UUO, ce modèle empêche l’hydronéphrose progressive, conduisant à des résultats pathologiques distincts. Cette procédure chirurgicale simple démontre un taux de réussite élevé et est prometteuse en tant que modèle classique pour l’étude de la néphropathie obstructive réversible et des traitements potentiels de la fibrose interstitielle rénale. De plus, il fournit une plate-forme pratique pour étudier les mécanismes de récupération de la néphropathie obstructive, de la régénération des cellules rénales et du remodelage tissulaire.

L’obstruction urétrale contribue de manière significative à la fibrose interstitielle rénale et à l’insuffisance rénale chronique (IRC), entraînant potentiellement des dommages structurels irréversibles et des déficiences fonctionnelles dans le rein¹. Bien que l’obstruction urétérale unilatérale (UUO) soit largement utilisée pour étudier les lésions rénales et l’IRC, elle ne reproduit pas avec précision les mécanismes de récupération spontanée qui se produisent après l’élimination d’une obstruction. Le modèle UUO consiste à ligaturer l’uretère gauche avec des sutures, ce qui entraîne une obstruction permanente, une dilatation urétérale, une hydronéphrose, une compression du parenchyme rénal et un amincissement cortical. L’examen histologique révèle généralement une dilatation tubulaire, une nécrose des cellules épithéliales tubulaires, une inflammation interstitielle progressive et une fibrose². Ce modèle étudie principalement la fibrose interstitielle rénale et la perte irréversible de la fonction rénale due à une obstruction persistante.

Cependant, de nombreuses maladies rénales rencontrées en pratique clinique, telles que l’obstruction causée par des calculs urétéraux ou des tumeurs, sont réversibles. Le modèle d’obstruction urétérale unilatérale réversible (RUUO) permet la restauration partielle de la structure rénale et de la fonction des voies urinaires, résolvant ainsi l’hydronéphrose. La récupération peut être évaluée à l’aide de techniques d’imagerie, d’un examen histologique et d’une analyse de biomarqueurs pour quantifier la réduction des lésions rénales et de la fibrose³. Ce modèle imite étroitement la phase de récupération de la néphropathie obstructive en milieu clinique et est plus adapté que l’UUO pour étudier des processus clés tels que l’inflammation, les réponses immunitaires, la régénération cellulaire et le remodelage tissulaire 4,5,6,7,8.

Le modèle RUUO permet aux chercheurs d’analyser la réparation et la régénération rénales après le soulagement des blessures, en abordant les limites de l’UUO dans les études dynamiques. En comparant différents points de temps avant et après l’obstruction, les chercheurs peuvent étudier les voies moléculaires impliquées dans les blessures et la réparation, notamment l’inflammation, l’apoptose, la fibrose et la régénération. Cette approche permet d’améliorer la compréhension des mécanismes de récupération rénale et d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles 2,3,4,5,8,9,10. Bien que la fibrose rénale soit souvent considérée comme irréversible, les observations cliniques suggèrent qu’un soulagement précoce de l’obstruction au cours des premiers stades de la fibrose peut arrêter ou même inverser la progression de la maladie. Le modèle RUUO fournit une plate-forme expérimentale précieuse pour étudier ce phénomène¹¹.

De plus, le modèle RUUO facilite l’étude de l’inversion de la fibrose après le soulagement de l’obstruction, offrant des informations sur les mécanismes de récupération et les thérapies antifibrotiques potentielles ^3,4. Par conséquent, ce modèle est très pratique pour la recherche translationnelle. L’objectif principal de ce modèle expérimental est d’induire une néphropathie obstructive par canulation urétérale, suivie d’un soulagement standardisé à un moment prédéfini pour assurer la cohérence. Il est optimisé pour sa simplicité, sa reproductibilité et sa sécurité, ce qui en fait un outil efficace pour la recherche expérimentale.

Cette étude sur les animaux a respecté les lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche de l’Hôpital pour enfants de l’Université de médecine de Chongqing. Au total, 27 rats Sprague Dawley (SD) mâles ont été obtenus commercialement et hébergés au Centre des animaux de laboratoire de l’Hôpital pour enfants de l’Université de médecine de Chongqing (SPF, numéro de licence : SYXK (Chongqing) 2007-0016). Les rats ont été maintenus dans des conditions de température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

Le protocole a été réalisé sur des rats SD mâles âgés de 6 à 8 semaines et s’applique aux rats de tous âges avec des uretères bilatéraux. Dans cette étude, quinze rats SD mâles âgés de 6 semaines ont été répartis au hasard en trois groupes : le groupe natif (n = 5), le groupe UUO (n = 5) et le groupe RUUO (n = 5). De plus, cinq rats SD âgés de 8 semaines (n = 5) ont été inclus comme groupe témoin supplémentaire. Pour établir le modèle RUUO, 12 rats ont été utilisés, et 7 rats supplémentaires ont été achetés pour tenir compte des risques potentiels tels que la mortalité peropératoire et postopératoire, les échecs chirurgicaux, l’obstruction incomplète et l’inversion infructueuse. Cela a permis d’obtenir un minimum de 5 rats par groupe pour les analyses ultérieures.

Toutes les interventions chirurgicales ont été effectuées en stricte conformité avec les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le personnel chirurgical a respecté les protocoles d’équipement de protection individuelle (EPI), y compris les masques chirurgicaux, les gants et les blouses. Des instruments chirurgicaux stériles ont été utilisés pour chaque procédure et ont été autoclavés avant et après utilisation pour maintenir la stérilité. Les déchets, y compris les objets tranchants et les échantillons biologiques, ont été éliminés conformément aux protocoles de gestion des déchets dangereux afin d’atténuer les risques de contamination et d’assurer la sécurité.

1. Préparation des animaux et des instruments

1. Effectuer toutes les procédures à l’aide d’instruments et de consommables stériles (autoclavés). Coupez le tube en silicone stérilisé (diamètre intérieur : 1,5 mm, diamètre extérieur : 2,5 mm) en segments d’environ 1 cm. Faites une incision longitudinale le long d’un côté de la paroi du tube pour une utilisation ultérieure.
2. Anesthésier les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital (40 mg/kg) (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Confirmez une anesthésie adéquate en vérifiant l’absence de réponses réflexes, telles que le réflexe de retrait de la pédale, lors du pincement des orteils. Appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie.
3. Épiler l’abdomen du rat de l’apophyse xiphoïde à la symphyse pubienne et étendre bilatéralement jusqu’à la ligne médiane.
4. Placez le rat en position couchée sur un coussin chirurgical chauffé et fixez ses membres avec des cordes en caoutchouc.
5. Drapez une feuille fenêtrée stérile pour maintenir un champ stérile. Préparez la peau avec une solution de povidone iodée. Faites une incision cutanée médiane le long de l’abdomen, s’étendant de la région sous-xiphoïde jusqu’à juste en dessous de l’ombilic, afin d’exposer adéquatement les reins et les uretères supérieurs.
6. Inciser les tissus sous-cutanés et le fascia le long de la ligne médiane à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Disséquez méticuleusement la peau et les tissus sous-jacents couche par couche, et exposez complètement l’espace rétropéritonéal à l’aide d’une pince à tissus.

2. Chirurgie obstructive pour l’obstruction urétérale unilatérale réversible

1. Rétractez l’intestin vers le côté droit de la cavité abdominale à l’aide d’un écouvillon stérile pour faciliter la visualisation directe de l’uretère gauche. Couvrez l’uretère avec de la gaze imbibée de solution saline pour éviter la dessiccation.
2. Disséquez et mobilisez l’uretère gauche à l’aide d’une pince microscopique, en libérant environ 1,5 cm des tissus environnants.
3. Placez un tube en silicone de 1 cm de long (diamètre intérieur : 1,5 mm, diamètre extérieur : 2,5 mm) sous l’uretère libéré. Utilisez une pince pour assurer une enveloppe complète dans le tube.
4. Lister le tube en silicone et la partie centrale de l’uretère à l’aide de fil de soie 3-0 pour induire une obstruction urétérale. Évitez une force de ligature excessive. Tirez progressivement le tube de silicone le long de l’axe longitudinal de l’uretère pour assurer une ligature sûre mais antidérapante.
5. Repositionnez soigneusement l’intestin dans la cavité péritonéale, en assurant un bon alignement sans tension ni obstruction.
6. Suturez le muscle abdominal et les couches fasciales à l’aide d’une suture non résorbable 2-0 avec une aiguille de coupe incurvée de manière continue pour fournir une résistance à la traction adéquate. Fermez la peau avec une suture non résorbable 4-0, assurant un alignement anatomique et une tension uniforme pour favoriser la cicatrisation et minimiser le risque de déhiscence de la plaie.
7. Désinfectez le site d’incision avec une solution de povidone iodée. Laissez les rats se rétablir dans des conditions contrôlées à une température constante pendant 7 jours.

3. Chirurgie de soulagement de l’obstruction urétérale unilatérale réversible

1. Préparez les animaux et les instruments nécessaires, en assurant une configuration stérile pour la réouverture abdominale et l’exposition complète de la cavité abdominale.
2. Disséquez soigneusement le nœud du tube en silicone à l’aide d’une lame de scalpel. Retirez le tube et irriguez la cavité abdominale avec une solution saline normale pour minimiser l’adhérence et le risque d’infection.
3. Repositionnez l’intestin et suturez l’incision de la paroi abdominale en couches à l’aide de sutures non résorbables 4-0. Stérilisez le site d’incision avec une solution de povidone iodée. Placez le rat dans un environnement à température contrôlée pour une période de récupération postopératoire de 7 jours.
4. Le 14e jour postopératoire, anesthésie les rats (en suivant la procédure mentionnée à l’étape 1.2) et prélève des échantillons de reins en sectionnant transversalement les reins en deux moitiés⁹.
5. Stocker la moitié dans du paraformaldéhyde à 4 % pour un examen histopathologique, et congeler rapidement l’autre moitié dans de l’azote liquide pour un stockage à −80 °C pour une analyse moléculaire ultérieure. Prélever des échantillons de sang pour des analyses biochimiques.
6. Effectuer l’euthanasie par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale selon les directives éthiques.

4. Évaluations de suivi

1. Suivre le poids corporel après l’RUUO pour évaluer la récupération globale. Comparez les changements de poids avec les groupes de contrôle et UUO.
2. Mesurer le poids et le volume des reins pour évaluer la récupération rénale.
3. Surveiller les taux de créatinine sérique (Scr) comme indicateur d’amélioration de la fonction rénale⁹.
4. Injecter du bleu de méthylène dans le bassinet du rein pour confirmer la perméabilité urétérale. Observer le péristaltisme et la coloration urétérales pour évaluer la récupération post-obstruction.
5. Effectuer une coloration H&E pour évaluer l’intégrité tubulaire et la structure rénale après RUUO ^8,10.
6. Effectuer la coloration trichrome de Masson pour évaluer la régression de la fibrose interstitielle rénale ^8,10.
7. Comparez les scores^{d’atteinte rénale 3,8} entre les groupes UUO et RUUO pour quantifier la récupération tissulaire.

Les effets de l’UUO et de sa libération ultérieure (RUUO) sur le poids corporel, le poids des reins, le volume des reins et les taux de créatinine sérique (Scr) ont été évalués, comme résumé dans le tableau 1. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET), avec n = 5 par groupe.

À 6 semaines, le groupe autochtone présentait un poids corporel moyen de 234 g ± 16 g, un poids rénal de 0,9107 g ± 0,0...

Ce modèle utilise un tube en silicone pour encercler l’uretère, fournissant un soutien structurel, suivi d’une ligature avec un fil de soie pour induire une obstruction complète de l’urétéral par compression. Après sept jours, la ligature et le tube en silicone sont retirés pour faciliter la décompression rénale et la restauration de l’intégrité et de la fonctionnalité des voies urinaires.

Les tubes en silicone, fabriqués à partir d’él...

Aucun.

Ce travail a été soutenu par le Programme pour l’innovation des jeunes en médecine du futur de l’Université médicale de Chongqing (W0056), le Projet conjoint d’innovation et de développement d’applications de la technologie de la MTC pour les sciences et la santé de Chongqing (2020ZY023877).