نموذج الفئران غير الناضج لانسداد الحالب أحادي الجانب القابل للانعكاس

يصف البروتوكول الحالي نموذجا تدريجيا وقابلا للتكرار لانسداد الحالب من جانب واحد.

انسداد الحالب من جانب واحد (UUO) هو سبب شائع لمرض الكلى المزمن (CKD) ، مما يؤدي إلى تطور التليف الخلالي الكلوي ويؤدي في النهاية إلى تلف الكلى الذي لا رجعة فيه. التخفيف من UUO أمر بالغ الأهمية. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لانسداد الحالب أحادي الجانب القابل للانعكاس (RUUO) في الأدبيات ، مما يتيح ملاحظة التغيرات الهيكلية والأضرار الوظيفية مع محاكاة التغيرات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية بعد تخفيف انسداد الحالب. في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج انسداد قابل للانعكاس في حالب الفئران من جانب واحد باستخدام أنبوب سيليكون. لوحظ تلف كبير في الكلى قبل تخفيف الانسداد ، مع ملاحظة الشفاء الجزئي بعد ذلك. على عكس UUO ، يمنع هذا النموذج استسقاء الكلية التدريجي ، مما يؤدي إلى نتائج مرضية مميزة. يظهر هذا الإجراء الجراحي البسيط معدل نجاح مرتفع ويبشر بالخير كنموذج كلاسيكي للتحقيق في اعتلال الكلية الانسدادي القابل للعكس والعلاجات المحتملة للتليف الخلالي الكلوي. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر منصة عملية لدراسة آليات التعافي من اعتلال الكلية الانسدادي ، وتجديد الخلايا الكلوية ، وإعادة تشكيل الأنسجة.

يساهم انسداد مجرى البول بشكل كبير في التليف الخلالي الكلوي وأمراض الكلى المزمنة (CKD) ، مما قد يؤدي إلى تلف هيكلي لا رجعة فيه وضعف وظيفي في الكلى¹. بينما يستخدم انسداد الحالب الأحادي الجانب (UUO) على نطاق واسع لدراسة إصابة الكلى ومرض الكلى المزمن ، إلا أنه لا يكرر بدقة آليات التعافي التلقائي التي تحدث بعد إزالة الانسداد. يتضمن نموذج UUO ربط الحالب الأيسر بالخيوط ، مما يؤدي إلى انسداد دائم ، وتمدد الحالب ، واستسقاء الكلية ، وضغط الحمة الكلوية ، وترقق القشرية. يكشف الفحص النسيجي عادة عن التمدد الأنبوبي ونخر الخلايا الظهارية الأنبوبية والالتهاب الخلالي التدريجي والتليف². يبحث هذا النموذج في المقام الأول في التليف الخلالي الكلوي وفقدان وظائف الكلى الذي لا رجعة فيه بسبب الانسداد المستمر.

ومع ذلك ، فإن العديد من أمراض الكلى التي تتم مواجهتها في الممارسة السريرية ، مثل الانسداد الناجم عن حساب الحالب أو الأورام ، قابلة للعكس. يسمح نموذج انسداد الحالب أحادي الجانب القابل للانعكاس (RUUO) بالاستعادة الجزئية لبنية الكلى ووظيفة المسالك البولية ، مما يؤدي في النهاية إلى حل استسقاء الكلية. يمكن تقييم التعافي من خلال تقنيات التصوير والفحص النسيجي وتحليل المؤشرات الحيوية لتحديد الانخفاض في إصابة الكلى والتليف³. يحاكي هذا النموذج عن كثب مرحلة التعافي من اعتلال الكلية الانسدادي في البيئات السريرية وهو أكثر ملاءمة من UUO لدراسة العمليات الرئيسية مثل الالتهاب والاستجابات المناعية وتجديد الخلايا وإعادة تشكيل الأنسجة^{4،5،6،7،8}.

يمكن نموذج RUUO الباحثين من تحليل إصلاح الكلى وتجديدها بعد تخفيف الإصابات ، ومعالجة قيود UUO في الدراسات الديناميكية. من خلال مقارنة النقاط الزمنية المختلفة قبل وبعد الانسداد ، يمكن للباحثين التحقيق في المسارات الجزيئية المشاركة في الإصابة والإصلاح ، بما في ذلك الالتهاب وموت الخلايا المبرمج والتليف والتجديد. يعزز هذا النهج فهم آليات التعافي الكلوي ويحدد الأهداف العلاجية^{المحتملة 2،3،4،5،8،9،10}. في حين أن التليف الكلوي غالبا ما يعتبر لا رجعة فيه ، تشير الملاحظات السريرية إلى أن الإغاثة المبكرة للانسداد خلال مراحل التليف الأولية قد توقف أو حتى تعكس تطور المرض. يوفر نموذج RUUO منصة تجريبية قيمة للتحقيق في هذه^{الظاهرة 11}.

علاوة على ذلك ، يسهل نموذج RUUO دراسة انعكاس التليف بعد تخفيف الانسداد ، مما يقدم رؤى حول آليات التعافي والعلاجات المضادة للتليف^{المحتملة 3،4}. وبالتالي ، فإن هذا النموذج عملي للغاية للبحث الانتقالي. الهدف الأساسي من هذا النموذج التجريبي هو إحداث اعتلال الكلية الانسدادي من خلال قنية الحالب ، متبوعا بتخفيف موحد في نقطة زمنية محددة مسبقا لضمان الاتساق. تم تحسينه من أجل البساطة والاستنساخ والسلامة ، مما يجعله أداة فعالة للبحث التجريبي.

التزمت هذه الدراسة التي أجريت على بالمبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى الأطفال بجامعة تشونغتشينغ الطبية. تم الحصول على ما مجموعه 27 فأرا من ذكور Sprague Dawley (SD) تجاريا وإيوائهم في مركز المختبر التابع لمستشفى الأطفال بجامعة تشونغتشينغ الطبية (SPF ، رقم الترخيص: SYXK (Chongqing) 2007-0016). تم الحفاظ على الفئران في ظل ظروف درجة حرارة خاضعة للرقابة مع دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة وكان لديها إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.

تم إجراء البروتوكول على ذكور الفئران SD التي تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع وينطبق على الفئران من جميع الأعمار مع الحالب الثنائي. في هذه الدراسة ، تم تعيين خمسة عشر من ذكور الفئران SD البالغة من العمر 6 أسابيع بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: المجموعة الأصلية (ن = 5) ، ومجموعة UUO (ن = 5) ، ومجموعة RUUO (ن = 5). بالإضافة إلى ذلك ، تم تضمين خمسة فئران SD تبلغ من العمر 8 أسابيع (ن = 5) كمجموعة تحكم إضافية. لإنشاء نموذج RUUO ، تم استخدام 12 فأرا ، مع شراء 7 فئران إضافية لحساب المخاطر المحتملة مثل الوفيات أثناء الجراحة وما بعدها ، والفشل الجراحي ، والانسداد غير المكتمل ، والانعكاس غير الناجح. هذا يضمن ما لا يقل عن 5 فئران لكل مجموعة للتحليلات اللاحقة.

تم إجراء جميع العمليات الجراحية بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية لرعاية المختبر واستخدامها. التزم الطاقم الجراحي ببروتوكولات معدات الحماية الشخصية (PPE) ، بما في ذلك الأقنعة الجراحية والقفازات والعباءات. تم استخدام أدوات جراحية معقمة لكل إجراء وتم تعقيمها قبل وبعد الاستخدام للحفاظ على العقم. تم التخلص من النفايات ، بما في ذلك الأدوات الحادة والعينات البيولوجية ، وفقا لبروتوكولات إدارة النفايات الخطرة للتخفيف من مخاطر التلوث وضمان السلامة.

1. إعداد والأدوات

1. إجراء جميع الإجراءات باستخدام أدوات ومستهلكات معقمة (معقمة). قم بقص أنبوب السيليكون المعقم (القطر الداخلي: 1.5 مم ، القطر الخارجي: 2.5 مم) إلى شرائح بحجم 1 سم تقريبا. قم بعمل شق طولي على طول جانب واحد من جدار الأنبوب للاستخدام اللاحق.
2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال (40 مجم / كغ) (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكد من التخدير الكافي عن طريق التحقق من عدم وجود استجابات انعكاسية ، مثل منعكس سحب الدواسة ، عند قرصة إصبع القدم. ضع مرهم العيون البيطري على العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
3. قم بإزالة بطن الجرذ من عملية الخنجري إلى ارتفاق العانة وتمتد بشكل ثنائي إلى خط الوسط.
4. ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة جراحية ساخنة وقم بتأمين أطرافه بحبال مطاطية.
5. ثنى ورقة معقمة للحفاظ على حقل معقم. تحضير البشرة بمحلول بوفيدون اليود. قم بعمل شق جلدي في خط الوسط على طول البطن ، يمتد من المنطقة تحت الخرسانة إلى أسفل السرة مباشرة ، لتوفير التعرض الكافي للكلى والحالب العلوية.
6. شق الأنسجة تحت الجلد واللفافة على طول خط الوسط باستخدام مقص جراحي. قم بتشريح الجلد والأنسجة الكامنة بدقة طبقة تلو الأخرى ، وكشف المساحة خلف الصفاق بالكامل باستخدام ملقط الأنسجة.

2. الجراحة الانسدادية لانسداد الحالب أحادي الجانب القابل للانعكاس

1. اسحب الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن باستخدام مسحة معقمة لتسهيل الرؤية المباشرة للحالب الأيسر. قم بتغطية الحالب بشاش مبلل بالمحلول الملحي لمنع الجفاف.
2. قم بتشريح وتعبئة الحالب الأيسر باستخدام ملقط مجهري ، مع تحرير حوالي 1.5 سم من الأنسجة المحيطة.
3. ضع أنبوب سيليكون بطول 1 سم (القطر الداخلي: 1.5 مم ، القطر الخارجي: 2.5 مم) أسفل الحالب المحرر. استخدم الملقط لضمان الغلاف الكامل داخل الأنبوب.
4. اربط أنبوب السيليكون والجزء الأوسط من الحالب باستخدام خيط حريري 3-0 للحث على انسداد الحالب. تجنب قوة الربط المفرطة. اسحب أنبوب السيليكون تدريجيا على طول المحور الطولي للحالب لضمان ربط آمن ولكن غير قابل للانزلاق.
5. أعد وضع الأمعاء داخل التجويف البريتوني بعناية ، مما يضمن المحاذاة المناسبة دون توتر أو انسداد.
6. خياطة عضلات البطن وطبقات اللفافة باستخدام خياطة غير قابلة للامتصاص 2-0 بإبرة قطع منحنية بطريقة مستمرة لتوفير قوة شد كافية. أغلق الجلد بخياطة 4-0 غير قابلة للامتصاص ، مما يضمن المحاذاة التشريحية وحتى التوتر لتعزيز الشفاء وتقليل مخاطر تسوء الجرح.
7. تطهير موقع الشق بمحلول بوفيدون اليود. اسمح للفئران بالتعافي في ظل ظروف خاضعة للرقابة عند درجة حرارة ثابتة لمدة 7 أيام.

3. جراحة الإغاثة من انسداد الحالب أحادي الجانب القابل للانعكاس

1. قم بإعداد والأدوات اللازمة ، مع ضمان إعداد معقم لإعادة فتح البطن والتعرض الكامل لتجويف البطن.
2. قم بتشريح عقدة أنبوب السيليكون بعناية باستخدام شفرة مشرط. قم بإزالة الأنبوب وري تجويف البطن بمحلول ملحي عادي لتقليل مخاطر الالتصاق والعدوى.
3. أعد وضع الأمعاء وخياطة شق جدار البطن في طبقات باستخدام 4-0 خيوط غير قابلة للامتصاص. تعقيم موقع الشق بمحلول بوفيدون اليود. ضع الجرذ في بيئة يتم التحكم في درجة الحرارة لمدة 7 أيام بعد الجراحة.
4. في اليوم 14 بعد الجراحة ، قم بتخدير الفئران (باتباع الإجراء المذكور في الخطوة 1.2) وجمع عينات الكلى عن طريق تقسيم الكلى بشكل عرضي إلى نصفين⁹.
5. قم بتخزين النصف في 4٪ بارافورمالدهايد للفحص النسيجي المرضي ، وقم بتجميد النصف الآخر بسرعة في النيتروجين السائل للتخزين عند -80 درجة مئوية للتحليل الجزيئي اللاحق. جمع عينات الدم للتحليلات الكيميائية الحيوية.
6. إجراء القتل الرحيم عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم باتباع الإرشادات الأخلاقية.

4. تقييمات المتابعة

1. تتبع وزن الجسم بعد RUUO لتقييم الشفاء العام. قارن تغيرات الوزن مع مجموعات التحكم و UUO.
2. قياس وزن الكلى وحجم الكلى لتقييم تعافي الكلى.
3. مراقبة مستويات الكرياتينين في الدم (Scr) كمؤشر على تحسن وظائف الكلى⁹.
4. حقن الميثيلين الأزرق في الحوض الكلوي لتأكيد سالكية الحالب. مراقبة التمعج الحالب والتلوين لتقييم التعافي بعد الانسداد.
5. قم بإجراء تلطيخ H&E لتقييم السلامة الأنبوبية والبنية الكلوية بعد RUUO^8،10.
6. إجراء تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لتقييم انحدار التليف الخلالي الكلوي^8،10.
7. قارن درجات التلف الكلوي^3،8 بين مجموعتي UUO و RUUO لتحديد تعافي الأنسجة.

تم تقييم آثار UUO وإطلاقه اللاحق (RUUO) على وزن الجسم ووزن الكلى وحجم الكلى ومستويات الكرياتينين في الدم (Scr) ، كما هو موجز في الجدول 1. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، مع n = 5 لكل مجموعة.

في 6 أسابيع ، أظهرت المجموعة الأصلية متوسط وزن ال...

يستخدم هذا النموذج أنبوبا من السيليكون لتطويق الحالب ، مما يوفر الدعم الهيكلي ، متبوعا بالربط بخيط حريري للحث على انسداد الحالب بالكامل من خلال الضغط. بعد سبعة أيام ، تتم إزالة الربط وأنبوب السيليكون لتسهيل تخفيف الضغط الكلوي واستعادة سلامة المسالك البولية ووظائفها.

اي.

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج ابتكار الشباب في طب المستقبل ، جامعة تشونغتشينغ الطبية (W0056) ، مشروع تشونغتشينغ للعلوم والصحة المشتركة للابتكار التكنولوجي وتطوير التطبيقات (2020ZY023877).