괴사, 세포사멸 및 혈소판 활성화의 특징을 보이는 Procoagulant Platelets의 포괄적인 분석

본 연구는 항인지질항체 증후군 및 암과 같은 혈전성 상태 중 혈소판 대사 및 신호 전달을 이해하는 데 중점을 두고 있으며, 이를 통해 새로운 바이오마커 및 치료 표적을 규명할 목적으로 하고 있습니다. 우리 그룹은 혈소판 대사가 혈소판 활성화 및 혈전증에 어떻게 기여하는지에 대한 최근 급증하는 관심의 최전선에 서 있습니다. 항혈소판제의 치료 효능뿐만 아니라 혈전증의 위험을 결정하기 위해 환자의 순환에서 혈소판 활성화 상태를 정확하게 특성화하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다.

호기성 해당과정(aerobic glycolysis), 오탄당 인산염 경로(pentose phosphate pathway) 및 지방산의 베타 산화(beta oxidation)는 혈소판의 에너지 대사 경로의 특징으로서 밝혀졌으며 치료 표적화에 대한 잠재력이 확립되었습니다. 이 프로토콜은 응집 혈소판과 구별되는 procoagulant platelets뿐만 아니라 apoptosis 또는 necrosis에 의해 세포 사멸을 겪는 혈소판의 식별 및 정확한 기능적 특성화를 돕는 역할을 합니다. 먼저 100마이크로리터의 혈소판 현탁액에 0.5마이크로리터의 0.5몰 스톡 염화칼슘 용액을 추가하여 세척된 인체 혈소판에 2.5밀리몰 칼슘을 보충합니다.

혈소판의 한 분획은 자극하지 않은 상태로 유지하고 나머지 분획은 트롬빈과 경련의 조합으로 실온에서 15분 동안 자극합니다. 자극 후, 자극된 혈소판 현탁액 100마이크로리터에 Annexin V, 팩 1개 및 항-CD62P 항체를 각각 1마이크로리터씩 추가합니다. 혈소판을 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, procoagulant 혈소판을 정량화하기 위해 유세포 분석으로 샘플을 분석하기 전에 동일한 부피의 2% 포르말린을 첨가하여 혈소판을 고정합니다. 혈소판 준비를 위해 세척된 인간 혈소판을 밀리리터당 100만 개의 혈소판 농도로 희석하고 2.5밀리몰의 칼슘을 보충합니다. 미토콘드리아 칼슘 검출을 위해 혈소판에 5마이크로몰 ROD2를 표시하고 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.

카스파제 활성화 분석을 위한 혈소판 준비를 위해 혈소판에 칼슘을 보충하고 분획을 자극한 후 자극된 혈소판 현탁액에 활성 카스파제 라벨링 다이를 추가합니다. 어둠 속에서 30분 동안 혈소판을 배양합니다. 30분 후, 유세포 분석으로 혈소판을 분석하기 전에 동일한 부피의 2%포르말린을 첨가하여 혈소판을 고정합니다.

그 결과, 트롬빈은 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 P-셀렉틴(P-selectin)을 모두 발현하는 혈소판의 비율에 대한 용량 의존적 증가를 유도했다. 트롬빈 자극은 또한 혈소판의 미토콘드리아 칼슘 수치를 시간에 따라 증가시키는 원인이 되었습니다. 그러나 트롬빈 자극은 혈소판의 미토콘드리아 막 전위를 감소시켰습니다.

트롬빈 자극은 혈소판에서 카스파제-8을 활성화시켰지만 카스파제-3 또는 7은 활성화되지 않았다.