Análise abrangente de plaquetas pró-coagulantes exibindo características de necrose, apoptose e ativação plaquetária

Nossa pesquisa se concentra na compreensão do metabolismo e sinalização plaquetária durante estados pró-trombóticos, como síndrome antifosfolípide e câncer, com a intenção de identificar novos biomarcadores e alvos terapêuticos. Nosso grupo tem estado na vanguarda de um recente aumento no interesse sobre como o metabolismo plaquetário contribui para a ativação plaquetária e trombose. A caracterização precisa do estado de ativação plaquetária na circulação dos pacientes para determinar o risco de trombose, bem como a eficácia terapêutica dos agentes antiplaquetários, continua sendo um desafio significativo.

A glicólise aeróbica, a via da pentose fosfato e a oxidação beta de ácidos graxos foram desvendadas como as principais vias de metabolismo energético nas plaquetas e seu potencial foi estabelecido para direcionamento terapêutico. Este protocolo serve para auxiliar na identificação e caracterização funcional precisa de plaquetas pró-coagulantes, distintas das plaquetas pró-agregatórias, bem como plaquetas submetidas à morte celular por apoptose ou necrose. Para começar, suplemente as plaquetas humanas lavadas com cálcio 2,5 milimolar adicionando 0,5 microlitros de solução de cloreto de cálcio 0,5 molar a 100 microlitros de suspensão plaquetária.

Mantenha uma fração de plaquetas não estimulada e estimule a fração restante com uma combinação de trombina e convulsivo por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a estimulação, adicione um microlitro de cada uma das anexinas V, pacote um, e anticorpo anti-CD62P a 100 microlitros de suspensões plaquetárias estimuladas. Incube as plaquetas no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após 30 minutos, fixar as plaquetas adicionando um volume igual de formalina a 2% antes de analisar as amostras por citometria de fluxo para quantificar as plaquetas pró-coagulantes. Para a preparação de plaquetas, diluir as plaquetas humanas lavadas até uma concentração de um milhão de plaquetas por mililitro e suplementar com cálcio 2,5 milimolar. Rotule as plaquetas com cinco ROD2 micromolares para detecção de cálcio mitocondrial e incube por 30 minutos no escuro.

Para a preparação de plaquetas para o ensaio de ativação de caspases, após suplementar as plaquetas com cálcio e estimular uma fração, adicionar matriz de marcação de caspase ativa às suspensões plaquetárias estimuladas. Incube as plaquetas por 30 minutos no escuro. Após 30 minutos, fixe as plaquetas adicionando um volume igual de 2% de formalina antes de analisar as plaquetas por citometria de fluxo.

Os resultados mostram que a trombina induziu um aumento dependente da dose na proporção de plaquetas que expressam fosfatidilserina e P-selectina. A estimulação da trombina também causou um aumento dependente do tempo nos níveis de cálcio mitocondrial nas plaquetas. No entanto, a estimulação da trombina resultou em uma redução do potencial da membrana mitocondrial nas plaquetas.

A estimulação da trombina ativou a caspase-8, mas não a caspase-3 ou 7 nas plaquetas.