우리 감사 혈액 기증자와 인원 캐나다 혈액 서비스 네트워크 센터에 적용 개발에 대 한 수집 및이 연구에 사용 된 혈소판의 생산. 우리 인정 캐나다 재단 혁신 그리고 마이클 스미스 재단 건강 연구를 위한 인프라 혈액 연구를 위한 UBC 센터에서 자금에 대 한. 게시에 대 한 자금 LightIntegra 기술 주식 회사, ThromboLUX의 제조 업체에 의해 제공 했다.

다음 프로토콜 모든 캐나다 혈액 서비스 (CBS) 지침에 따라 수행 되었습니다. 자원 봉사자 수 있습니다 그들의 기부금을 동의 했다이 연구를 수행 하는 데 사용. 혈소판 집중 CBS 표준 운영 절차에 따라 준비 되었다. 여기에 설명 된 모든 성능 테스트 수행 되었다 센터에서 혈액 연구 브리티시 컬럼비아 대학교, 밴쿠버, 캐나다에 대 한 기관 연구 윤리 위원회 승인.
1. 품질 관리 검사
<ol><li>DLS 시스템의 올바른 작동을 확인 하는 날 테스트 당 품질 관리 검사를 적어도 한 번 수행 합니다. 사용에 대 한 제조업체의 지침에 따라 제공 된 제어 구슬 (50 nm radius)를 측정 합니다.</li>
	<li>냉장에서 제어 유리병을 검색 하 고 따뜻한 실내 온도에 15 분을 허용. 구슬 사용 하기 전에 실내 온도에 equilibrate 해야 합니다.</li>
	<li>샘플을 준비 하는 워밍업 기간 15 분 레이저 첫 번째 샘플은 테스트를 위해 준비 하는 시간에 의해 완성 전에 DL 시스템을 켭니다.</li>
	<li>일단 콘솔 시작 했다에 로그인 하 고 시스템 테스트 옵션 컨트롤 샘플 측정을 선택 터치 스크린에 지침을 따르십시오.</li>
	<li>소용돌이 믹스 10 유리병 대표 샘플을 보장 하는 s.</li>
	<li>100 µ L 고정된 볼륨 피 펫, 피 펫 팁 및 테스트 키트에서 모 세관을 사용 하 여 컨트롤 구슬과 모 세관을 채우십시오.</li>
	<li>테스트가 완료 되 면 DL 시스템의 화면의 지침을 따릅니다. 참고: 제어 구슬 테스트 결과 자동으로 컨트롤 비드 바코드 라벨 및 패스에 저장 된 정보에 비해 또는 샘플 정보 뿐 아니라 실패 알림 테스트의 끝에 DLS 시스템 화면에 표시 됩니다.</li>
</ol>2. 혈소판 집중에서 샘플을 얻기
참고:이 단계는 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 모 세관을 테스트 하는 DL에 혈소판 수혈에서 비-침략 적 샘플링에 대 한 프로세스를 설명 합니다. 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 필요한 액세서리: 튜브 실러, 수동 튜브 스 트리 퍼가 위, 그리고 스플래시 방패.
<ol><li>안 된 재고에서 혈소판 집중을 제거 합니다.</li>
	<li>사용 하지 않는 샘플링 주머니에서 혈소판 제품의 샘플을 얻기 (2.3 단계로 진행) 또는 튜브 세그먼트 (비어 있는 경우 2.4 단계로 진행 또는 2.5 단계 아니라면 빈). 주머니를 분리 하려면 튜브 또는 세그먼트 튜브 튜브 실러를 사용 합니다. 튜브 실러, 운영을 제조업체의 지침을 따르십시오. 짧게, 2 개의 온수 턱 사이 정확한 위치에 봉인에 튜브 클램프. 핸드헬드 장치에서 녹은 튜브 함께 누르고 (기간 녹색 빛으로 표시 됩니다) 레버를 누르는 동안 높은 압력에서 냉각 결과 영구, 누출 증거 물개에.</li>
	<li>
주머니에서 샘플링
	<ol>
<li>5 부드러운 수평 운동에 의해 잘 혈소판 가방의 콘텐츠를 혼합 s (팁 끝에 5 번).</li>
		<li>주머니에 클램프를 엽니다. 주머니 대피 되 고 자체적으로 작성 합니다. 100 µ L 샘플 DL 테스트에 필요한 것으로 주머니를 완전히 채울 필요는 없습니다.</li>
		<li>열 씰링 연결 튜브 튜브 실러에 의해 가방에서 주머니를 분리 합니다. 3 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
빈 배관에서 샘플링
	<ol>
<li>혈소판 가방 확인 튜빙 빈 저장 된 및 튜브 블록 장소에 아직도 있다. 시각적으로 상당한 양의 튜브에 혈소판 집중이 아닌지 확인 하 고 튜브를 검사 합니다. 튜빙 비어 있지 않은 경우 2.5 단계로 진행 합니다.</li>
		<li>롤러 사이 튜브를 집어넣은 핸들을 압축 하 여 가능한 튜브 블록 주변으로 배관에 튜브 스 트리 퍼를 닫습니다.</li>
		<li>수직으로 가방을 걸어 고 압축 스 트리 퍼 핸들 유지.</li>
		<li>폐쇄는 스 트리 퍼를 유지 하는 동안 튜브 블록을 해제 합니다.</li>
		<li>천천히 천천히 스 트리 퍼 뒤에 채우기 위해 튜브에 대 한 허용 하는 빈 튜브 아래로 스 트리 퍼를 당겨. 스 트리 퍼 아래 섹션은 완전히 팽창 될 때까지 또는 스 트리 퍼 튜브의 끝의 1 인치 이내 때까지 계속 합니다.</li>
		<li>일단 멈추는 포인트는 스 트리 퍼와, 사용 열 튜브 실러 밀봉 튜브 스 트리 퍼 1 인치.</li>
		<li>수동 튜브 스 트리 퍼의 핸들을 해제 합니다.</li>
		<li>열 인감 다시 테스트 세그먼트를 만드는 이전 인감 위에 1 ~ 2 인치.</li>
		<li>혈소판 단위에서 테스트 세그먼트를 잘라. 이 세그먼트는 DL 테스트에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비어 있지 않은 튜브에서 샘플링
	<ol>
<li>수직으로 가방을 꽉과 장소를 하는 경우에 배관 블록을 놓습니다.</li>
		<li>시각적으로 어떤 중대 한 단단한 덩어리 인지 확인 하 고 튜브를 검사 합니다. 단단한 덩어리로 존재 할 경우 가방에 박탈 될 수 없는 그런 그들 위에 봉인.</li>
		<li>가까운 가능한 배관의 밀봉된 끝으로 배관에 튜브 스 트리 퍼를 닫습니다.</li>
		<li>집어넣은 튜브 롤러 사이 그리고, 클램핑 힘을 유지 하면서 핸들을 압축 하 여 가방에는 튜브의 내용을 스트립 가방 쪽으로 튜브 스 트리 퍼 튜브를 따라 이동 합니다.</li>
		<li>걸려 후크에서 혈소판 가방을 제거 하 고 부드럽게 혼합 5 가방 s 팁 그것은 끝에 5 번 스 트리 퍼를 유지 하는 동안에 의해 폐쇄.</li>
		<li>폐쇄 스 트리 퍼를 유지 하면서 수직으로 가방을 걸어.</li>
		<li>천천히 천천히 스 트리 퍼 뒤에 채우기 위해 튜브에 대 한 허용 하는 빈 튜브 아래로 퍼 당겨. 스 트리 퍼 아래 섹션은 완전히 팽창 될 때까지 또는 스 트리 퍼 튜브의 끝의 1 인치 이내 때까지 계속 합니다.</li>
		<li>일단 멈추는 포인트는 스 트리 퍼와, 사용 열 튜브 실러 밀봉 튜브 스 트리 퍼 1 인치.</li>
		<li>스 트리 퍼를 놓습니다.</li>
		<li>열 인감 다시 테스트 세그먼트를 만드는 이전 인감 위에 1 ~ 2 인치.</li>
		<li>차단 하 고 튜브의 마지막 부분을 삭제.</li>
		<li>혈소판 단위에서 테스트 세그먼트를 잘라. 이 세그먼트는 DL 테스트에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 모 세관을 테스트 하는 DL로 샘플 작성
<ol><li>스플래시 방패와 깨끗 하 고 건조가 위를 사용 하 여 튜브 또는 세그먼트 테스트 주머니의 한쪽 끝을 잘라. 참고: DL 테스트에 사용 되는 모 세관 즉시 채울 수 합니다.</li>
	<li>모 세관 (조립된 100 µ L 고정된 볼륨 피 펫 피 펫 팁, 모 세관)는 모 세관으로 열린된 주머니 또는 튜브 세그먼트에서 직접 샘플을 그리는 샘플링 도구를 사용 하 여 입력 합니다.</li>
	<li>부드럽게 부드러운 트위스트 및 용지함에 대 한 압력을 적용 하는 동안 세관 실 란 트로 채워진된 모 세관을 추진 하 여 채워진된 모 세관의 하단 인감.</li>
	<li>단단히 세관 실 란 트에 포함 된 고정 볼륨 피 펫 및 모 세관 남아 보장 하는 모 세관에서 팁 100 µ L를 분리 합니다.</li>
	<li>모 세관 튜브 실 란 트 트레이에서 모 세관 제거, 이소프로필 알코올 솜으로 닦 고 아무 공기 거품이 부드럽게 모 세관의 하단을 터치 하 여 갇혀 있다 확인 합니다.</li>
	<li>DLS 시스템에 모 세관을 놓습니다.</li>
</ol>4. DL 테스트 수행
<ol><li>MP 테스트 옵션 microparticle 콘텐츠의 혈소판 샘플을 측정 하기 위한 새로운 DL 테스트 시작을 선택 합니다.</li>
	<li>샘플 정보 (기부 식별 번호 (ISBT), 컬렉션/생산 만료 날짜와 제품 코드) 입력 바코드 스캐너를 사용 하 여 또는 수동으로.</li>
	<li>제품 코드 사용할 수 있는 경우는 DLS 시스템 수 있습니다 유체 매체 정보를 추출, 적절 한 액체 매체를 수동으로 선택 (대부분 혈소판에 대 한 집중 플라즈마를 선택 하지만 혈소판 첨가제 솔루션 (PA)를 포함 하는 샘플에 대 한 입력은 잔여 플라즈마의 비율)입니다. 참고: 공칭 65%에서 파 비율에 작은 편차 최소 계산된 MP 반지름만 하지 %MP 영향을 미치는 점도 (DLS 시스템에 의해 자동으로 계산 해)에 작은 오류를 발생 합니다.</li>
	<li>DLS 시스템 지시 하는 때에 모 세관을 놓고 테스트를 시작 합니다.</li>
	<li>테스트가 완료 되 면 모 세관 홀더 및 시설 지침에 따라 적절 하 게 소모품의 dispose에서 샘플을 제거 합니다. 모 세관 홀더 및 시설 지침에 따라 적절 하 게 소모품의 dispose에서 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>결과, 대 한 예를 들어 오렌지에 해당 하는 색상으로 혈소판 가방 태그 비-활성화 (균질) %MP 동등 하거나 15% 및 대 한 분홍색 아래 활성화 (이기종) % MP 15% 이상.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig1.jpg"> 그림 1 : 방법 개요. 병원 혈액 은행에서 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 수행 하는 단계의 개요: 미 식별 하 테스트는 DL 수행 집중, DL 측정 모 세관으로 샘플을 로드는 혈소판에서 샘플을 얻기 그리고 보고 microparticle 활성화 된 혈소판을 식별 하기 위해 콘텐츠를 사용 하 여. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

EMS는 LightIntegra 테크놀로지, microparticle 및 혈소판 품질 테스트를 위한 ThromboLUX 시스템을 개발 하는 의료 기기 회사의 설립자입니다. 다른 모든 저자는 LightIntegra 기술의 직원이 있습니다. 생산 및이 문서에 대 한 무료 액세스 LightIntegra 기술 주식 회사에 의해 후 원합니다

이 프로토콜 microparticle 심사 혈소판 집중 같은 생물학 견본에서 발견 높은 입자 농도 대 한 최적화에 대 한 동적 산란 방법을 설명 합니다. DL 방법은 기본적으로 정확 하 게 크기를 측정 하 표준화 된다. 미의 상대 농도 절대 농도에 혈소판 농도가 알려져 있고 혈소판 피크 지역 때 참조 피크19로 변환할 수 있습니다. 혈액학 분석기 혈소판으로 농도 얻은 일반적으로 또는 교류 cytometers 이러한 방법을 DL 동반자 기술을 고려 될 수 있다.
DLS 시스템의 기능 제어 구슬을 정기적으로 실행 하 여 보험입니다. 증류수는 배경 잡음은 최소한의 확인을 측정할 수 있습니다. 상용 혈소판 기준 MP 긍정적인 컨트롤로 125 nm 반경 구슬의 추가 후에, 및 MP 음수가 컨트롤로 분석할 수 있습니다. 관심의 농도 MP의 생물 학적 범위 내에서 절차는 실용적이 고 빠른 혈액 은행 루틴의 일환으로 수행 하는.
Cytometry, 반대로이 방법은 하지 기반으로 입자의 산란 강도 하지만 오히려 그들의 브라운 모션의 속도 비교 합니다. 따라서, exosomes는 또한 그들의 작은 크기에도 불구 하 고 검출 될 수 있다 하 고 MP에서 별도로 보고 됩니다.
심사 도구로 설계,이 방법의 한계 미의 다른 유형을 구별을 하지 못하는 관련이 있습니다. 추가 격리 단계; 사용 개선 위한 잠재적인 공간이 있다 마그네틱 비드 캡처를 결합 하는 항 체를 통해 미의 특정 제거 전후 샘플 테스트 수 있습니다. 또한, 모든 미는 chylomicrons 혈47,48 및 작은 박테리아 또는 바이러스6 형성 microparticle 범위에 보고 됩니다 때문에 파생 셀 감지 가정 수 없습니다. 그러나, 다른 안전 장치를 피하기 위해 높은 lipemic 또는 병원 혈액 은행 재고 입력을 오염 된 혈소판 혈액 공급 내에서 존재 한다.
응고 제 샘플에서의 혈소판 활성화 및 따라서 MP 콘텐츠49의 범위를 영향을 줍니다. 다른 제품의 비교에 대 한이 요인은 고려 될 필요가 있다. 또한, 플라즈마 파 같은 MP 무료 정지 미디어의 교환 MP 콘텐츠 및이 결정 하기 위한 임계값에 영향을 미칠 것입니다-경우에 집중에서 잔여 플라즈마 내에서 남아 있는 원래 MP 콘텐츠의 1/3 정도 따라서 낮은 MP 콘텐츠 임계값 100% 플라스마에서 혈소판 활성화의 동일한 수준을 나타냅니다. 백분율 MP 혈소판 기준 MP 내용입니다. 이전 파 제품의 평균 혈소판 수는 낮은 평균 %MP 되었다 아직도 9.519보고 되었다. 싶어 서 혈소판 허가 미국에 대 한 %MP 임계값은 현재 10%로 설정 됩니다.
혈소판 집중에 MP의 기본 소스는 기증자, 혈소판에 긴장을 일으키는 원인이 되는 프로세스 스트레스 혈소판의 민감성에 따라 MP 수준 증가-혈소판 활성화 이미 높은 경우 사소한 스트레스와 같은 확장 된 수명, 병원 체 비활성화, 세척, 방사선 또는 장거리 전송은 MP 내용에 상당한 증가를 발생할 수 있습니다. 이러한 스트레스의 크게 균질, 비 활성화 혈소판19영향을 보였다. 또한, 주의 해야 될 모 세관 내의 샘플 구성 변경에 대 한 잠재력을 지불 아니라면 준비 (이 프로토콜의 단계 3의 완료) 후 즉시 테스트.
이 프로토콜의 초점은 결정 입자와 혈소판 활성화의 biomarkers로 미를 사용 하 여 혈소판 수혈에의 구성에 있습니다. 혈소판 수혈 중 비 활성화 (오렌지) 태그 또는 활성화 (핑크) 15%의 microparticle 백분율 임계값에 따라. MP 100% 플라스마에 있는 혈소판에 대 한 경험적으로 여러 사이트에서 평균 66번째 백분위 수로 결정 했다 15%의 임계값입니다.
일상적인 microparticle DL와 심사에 따라 혈소판 재고 관리의 목적은 비 면역 혈소판 중을 방지 하 여 환자 관리 및 드라이브 비용 효율성을 향상 시킬 것입니다. 혈소판 가방의 심사에 대 한 DL 시스템의 구현에는 혈소판 중 위험이 가장 환자 인구를 비 활성화 된 혈소판을 직접 사용자 수 있게 된다.

미에 관심은 주로 셀을 셀 통신 및 생물 학적 과정에 그들의 참여 주위 revolved 있다. 1 , 2 , 3 최근 미 또한 받고 있다 관심 자가 면역 및 심혈 관 질환의 잠재적인 조기 진단 마커로. 4 , 5 미로 알려진 또한 extracellular 소포 또는 exosomes는 널리 조사 cytometry에 의해. 불행 하 게도, 기존의 흐름 cytometry 프로토콜 표준화 노력에도 불구 하 고 아무런 합의에 있다 사용할 최적의 프로토콜. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
기존의 cytometry 특정 MP 모집단 특성을 수 있습니다, 비록11 그것은 몇 가지 한계를 보고. 11 , 12 , 13 , 14 이러한 제한 중 일부는 소위에 있는 더 높은 전원 레이저 및 검출기를 사용 하 여 해결 되었습니다 앞으로 15 °-25 °에서 검출 뿐만 아니라 "작은 입자 옵션",15,16 각도 분산형 및 칼 집 압력 수정 . 17 , 18 그럼에도 불구 하 고, 이러한 정교한 방법으로 결합 될 수 있는 신속 하 고 쉽게--를 사용 하 여 심사 방법 아직도 필요 조기 진단 마커로 미 활용 합니다. 미의 높은 수준은 정상적인 혈액 기증자19 의 1/3 정도에서 감지 되며 subclinical 조건을 나타낼 수 있습니다. 따라서, 헌 혈 된 혈액 제품에 높은 microparticle 수준 취약 받는 호환 되지 않을 수 있습니다. 20
혈소판 수혈을 제공할 때 비 면역 중-조건 어떤 점에서 환자의 몸 연속 수혈을 거부 하 고 순환 하는 혈소판의 상당 부분을 허용 하지 않습니다의 위험이 있다. 21 , 22 비 면역 중 낭비 수혈 될 수 있습니다, 그리고 건강 합병증 환자, 그리고 확장 된 병원에 대 한 유지 됩니다. 23 미의 높은 숫자를 포함 하는 혈소판 수혈 비 면역 중 취약 한 혈액 종양 환자에서의 개발에 대 한 기여 요인 수 있습니다. 20 미 취약 한 환자에 대 한 위험을 줄일에 대 한 심사에 의해 혈소판 수혈의 구성에 따라 혈소판 재고 관리 가능 하다. 그러나, 대부분 microparticle 테스트 혈소판5,12 에서 미의 격리가 필요 또는 그렇지 않으면 매우 노동 집약적인24,25 따라서 하지 구현할 수 있습니다 정기적으로 병원에 혈액 은행입니다.
설명 하는 기술은 여기 동적 산란 (DL)-광자 상호 관계 분광학 또는 준 탄성 산란을 사용 합니다. 수십 년 동안, 동적 산란 광범위 하 게 사용 되었습니다 제약 업계에서 자주 약물 제형 또는 유화 액 특성을 서브 미크론 범위에 있는 입자 크기. 26 , 그러나 27 , 이러한 응용 프로그램 개발 도구는 없습니다 최적화 화면 혈액 제품. 새로운 DLS 시스템 기술 한계를 극복 하 고 동적 빛 산란 혈소판 수혈의 심사에 대 한 유용 하 게 개발 되었습니다. 28
동적 산란 측정 레이저 빛으로 중단된 한 입자를 조명 하 고 흩어져 빛의 강도에 이동 하는 입자의 결과의 시간 변화를 분석 하 여 수행 됩니다. 또한,이 방법은 입자 속도 크기 사이의 반비례 관계를 사용 하 여 작은 입자 이동 하 고 큰 입자 크기 분포 및 샘플 구성의 상대 농도에 정보를 제공 하도록 천천히-이동 합니다. 평균 microparticle DL을 사용 하 여 microparticle 구성 요소의 콘텐츠 및 평균 반지름을 측정할 수 있습니다. 혈액 제품에 미의 콘텐츠 % MP 50-550 nm에서 입자 반지름에 대 한 측정 된 히스토그램에서 지역을 기반으로 제공 됩니다. 50 아래 반지름을 가진 입자를 동안 nm를 DL로 검색 하 여 보고 DLS 시스템 %MP에서 포함 되지 않습니다. 미에서 혈소판을 분리 하는 대신 혈소판 수혈의 이종 미 및 샘플에 있는 혈소판의 상대적인 내용에 따라 결정 됩니다. 사실, 혈소판 및 microparticle 봉우리의 비율 혈소판 수가 알려진 경우 절대 MP 농도 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 19
DLS 시스템은 인간의 혈액 이나 혈액 제품에서 파생 된 표본에서 발견 하는 미에 대 한 질적 및 양적 정보 의료 전문가 제공 합니다. Cytometry, 전자 현미경,29 나노 분석30 또는31 감지 가변 저항 펄스 추적 대체 기술을 통해 설명 DL 기술의 주요 이점은 이다 샘플 준비: aliquots 혈소판 집중의 혈소판, 샘플 희석 또는 다른 수정에서 MP를 분리 하지 않고도 직접 측정할 수 있습니다. 9 , 17 또한, DL 절대 크기 조정 방법입니다 하 고 적절 한 굴절률을 가진 교정 구슬의 부족에서 고통을 하지 않습니다. 14 , 32
혈소판 활성화 및 MP 콘텐츠 사이의 상관 관계 이전 현미경33,20 에 의해 표시 되었습니다 및 병 적인 조건15,34, 에서 MP 콘텐츠 증가에서 유추할 수 있습니다. 35 , 36 고 조건 생체 외에서 혈소판을 활성화 하기 위하여 알려진. 19 , 37 , 그러나 38 , 더 연구는 필요 DL 측정 microparticle 콘텐츠 및 혈소판 활성화의 관계를 완전히 이해 합니다. 현재 우리의 지식에 따라 활성화 된 혈소판은 최고의 미의 높은 번호가 들어 혈액 종양 환자 비 활성화 누릴 적극적으로 환자39, 출혈의 치료 치료에 사용 되 없이 혈소판 또는 미20의 낮은 수준. 그것은 최근에 알려졌다 복구 및 안정적이 고, 주로 비 출혈 혈액 종양 환자40 단일 수혈에 이러한 혈소판의 생존 기증자 혈소판의 생체 외에서 응답 크게 영향 되지 않았다 그 . 이 발견에서 그 높은 MP 콘텐츠 식별 하는 혈소판 활성화 또한 아무 역할도 중요 한 환자 들의 예방 치료에 종결 될 수 있습니다. 그러나, 좁은 환자 선택 때문이 연구 해결 하지 않았다 복잡 한 환자 열 병 (연구에서 제외)에 대 한 기증자 요인의 영향, 하지 안정 하 고 많은 단지 하나 이상의 혈소판 수혈을 받을. -보유 하 고 하 중을 줄이기 위해 약속-어떻게 이러한 환자의 경우의 복잡성을 줄일 수 있습니다 질문 답이 남아 있습니다.
미 조기 표식 염증41,,4243,44 및 혈소판 활성화45 이며 따라서 많은 정상적인 기증자에서 발견. 19 따라서, 활성화 된 혈소판과 미는 혈소판 기부에. 그것은 합리적인 가설을 열, 즉, 완전히 활성화 된 타고 난 면역 시스템, 환자 활성화 된 혈소판의 수혈의 추가 도전 용인할 수 없다. 그러나, 연구는이 가설을 증명 하기 위해 필요 합니다. Microparticle 심사 혈소판 수혈의 내용에 대 한 현재의 불확실성을 완화 하 고 환자의 치료의 복잡성을 줄일 수 있습니다.
병원 혈액 은행에 비 활성화 활성화 된 혈소판의 비율에 따라 달라 집니다 주로 기증자 인구 전송, 방사선 조사, 병원 체 비활성화 및 혈소판 활성화에 증가 시킬 수 있는 다른 프로세스에 훨씬 낮은 정도로 집중 한다. 19 미국에 주요 병원 혈액 은행에서 데이터 보였다 혈소판 재고의 평균 조성은 활성화 하는 49%와 51% 비 활성화 (활성화 된 혈소판에 대 한 범위: 38-62%, 개인 커뮤니케이션). 혈액 제품 공급자 또는 병원 혈액 은행 microparticle에 의해 표시 된 혈소판 활성화를 기반으로 하는 그들은 생산 또는 수신, 및 그들의 재고를 관리 하려면 얼마나 많은 활성화 하 고 활성화 되지 않은 혈소판 집중을 알고 싶은 경우 콘텐츠,이 프로토콜은 그들에 대 한 적절 한 수 있습니다.
혈소판 성분 병원 혈액 은행 직접 상의 prophylactic에 대 한 비-활성화, 동종 혈소판 사용 및 활성화, 치료 적 사용에 대 한 다른 유형의 혈소판 수에 따라. 혈소판 검사 병원을의 환자 진료를 개선 하 고 비용을 감소 하는 사용 가능한 인벤토리 사용을 극대화 하기 위해 수 있습니다. 이 프로토콜은 기본 처리 및 혈액 제품의 조작에 익숙한 실험실 직원에 대 한 것입니다.
여기 어디 microparticle 내용에 따라 제품을 선택 하는 것이 바람직하다 미 병원 혈액 은행 재고 관리를 일상적으로 적용 될 수 있는 혈소판 수혈에 대 한 검사 방법이입니다. 이 프로토콜의 목적은 기증된 혈소판의 심사에 대 한 구현 및 DL의 평가 개요입니다. 설명된 프로토콜 샘플, 혈액 은행 작업 흐름 및 성능 특성으로 테스트의 통합 비-침략 적 접근의 일반적인 질문을 해결 합니다.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >ThromboLUX-M</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc.&#160;</td>
			<td >LPN120</td>
			<td >DLS System</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ThromboSight Software</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc.&#160;</td>
			<td >LPN124</td>
			<td >DLS analysis software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Capillaries</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE)</td>
			<td >LPN065</td>
			<td >Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MiniPet&#160;</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific)</td>
			<td >LPN082</td>
			<td >100 &#181;L fixed volume pipette for sampling&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroFlex 1-200 &#181;L Pipette tips</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific)</td>
			<td >LPN080</td>
			<td >Pipette tips for sampling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Critoseal&#160;</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific)</td>
			<td >LPN075</td>
			<td >Capillary Tube Sealant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dukal Alcohol Pad or equivalent</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.)</td>
			<td >LPN085</td>
			<td >Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Control beads, 50 nm radius</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.)</td>
			<td >LPN128</td>
			<td >Control beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 &#181;m</td>
			<td >PolySciences Inc.</td>
			<td >64060</td>
			<td >Standard microbeads: 1.5 &#181;m radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 &#181;m; 1% solids suspensions in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm</td>
			<td >PolySciences Inc.</td>
			<td >64014-15</td>
			<td >Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genesis BPS RapidSeal II or equivalent</td>
			<td >Genesis BPS</td>
			<td >428-SE640</td>
			<td >Tube sealer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent</td>
			<td >Fresenius Kabi</td>
			<td >6R4452</td>
			<td >Manual tube stripper</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent</td>
			<td >CardinalHealth</td>
			<td >S1389-75</td>
			<td >Splash Shield</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Vortex Mixer or equivalent</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >6775</td>
			<td >Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACSCanto II Flow cytometer&#160; with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >338960</td>
			<td >Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine screening method for microparticles in platelet transfusions

혈소판 집중에서 microparticle 콘텐츠 심사에 따라 혈소판 재고 관리 병원 혈액 은행에 대 한 새로운 품질 개선 이니셔티브 이다. 셀 미 (MP) 때 그들은 스트레스에서 조각입니다. 혈액과 혈액 구성 세포, 가장 주목할만 하 게 활성화 된 혈소판의 다양 한에서 세포 조각을 포함할 수 있습니다. 응고에 hemostasis 타고 난 면역 세포 및 주요 선수로 그들의 역할을 수행할 때 혈소판 모양을 변경 하 고 미를 생성 합니다. 동적 산란 (DL) 함께-microparticle 탐지를 기반으로 그것은 비 활성화 (낮은 microparticle) 혈소판 수혈에서에서 활성화 (높은 microparticle)를 구분 하 여이 부족 한 혈액 제품의 사용을 최적화. 이전 연구는 내 화 되 고의 위험을 줄일 하 고 환자 치료를 개선 수 혈액 종양 환자에서 예방 사용에 대 한 비 활성화 된 혈소판을 제공 하 나왔다. 이 검사 방법의 목표는 정기적으로 차별화 하는 비 활성화 된 혈소판에서 활성화. 여기 설명 하는 방법을 설명 병원 혈액 은행에서 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 수행 하는 단계: 테스트를 수행 하는 DL DL 측정 모 세관으로 샘플을 로드 혈소판 수혈에서 샘플을 얻기 미, 및 활성화 된 혈소판을 식별 보고 microparticle 콘텐츠를 사용 하 여 식별 합니다.

평균 준비 시간 DLS 시스템을 사용 하 여 프로세스를 심사 하는 혈소판은 그림 1에 요약 됩니다. 혈소판은 혈액에서 영수증의 시간에 DLS 시스템으로 테스트 됩니다. 표 1 에 설명으로 숙련 된 사용자에 대 한 평균 준비 시간 정리 하는 동안 2 분 23 s 이며 테스트 후 작업 시간 14 s와 46 s, 각각. 총, 평균 사용자가 3 분 및 23 테스트 당 실습 시간의 s.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>활동</td>
			<td>활성 시간</td>
			<td>도보 거리 테스트 시간</td>
			<td>총</td>
		</tr>
<tr>
<td>DLS 시스템 준비</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플링 도구 조립</td>
			<td>28 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>세그먼트를 얻을</td>
			<td>52 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>모 세관을 작성 하 고 테스트 시작</td>
			<td>49 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>5 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>정리</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>태그 및 재고 혈소판 가방</td>
			<td>46 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 당 필요한 총 시간</td>
			<td>3 분 23 s</td>
			<td>5 분</td>
			<td>8 분 23 s</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 활성 테스트 시간 고장. 테스트 자체는 평균 기간이 5 분의 도보 멀리 테스트가입니다. 평균 사용자 3 분 23의 DL 시스템 테스트를 위한 준비,이 프로토콜에 따라 샘플 테스트와 혈소판 가방 태그 걸립니다.
정밀 DLS 시스템의 정밀도 0-7 세 microparticle 수준 평가 되었다 %, 12-25%, 28-75%. %MP 임상 관련 범위 3-75% 이다. 두 연산자는 병렬로 두 DLS 시스템 운영 16 일에 대 한 낮은, 중간 및 높은 제어 샘플 테스트. 샘플 테스트 하루에 중복, 하지만 임의의 순서로 테스트 되었습니다.
표 2 는 혈소판을 기준으로 % 미 (%MP)에 대 한 DL 측정 장치 내에서 정밀 요약 되어 있습니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Microparticle 콘텐츠</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>낮은</td>
			<td>매체</td>
			<td>높은</td>
		</tr>
<tr>
<td>%MP (%)을 의미</td>
			<td>4.4</td>
			<td>19.5</td>
			<td>53.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 편차 (%)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.6</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>40.4</td>
			<td>13.2</td>
			<td>10.6</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: % 미 (%MP)의 장치 내에서 정밀. 매우 낮은 microparticle 콘텐츠 작은 혈소판 %에 기여할 수 있습니다 MP 인 낮은 microparticle 콘텐츠 샘플에 대 한 다양성을 증가 했다.
표 3 50-550 nm 사이의 평균 microparticle 반지름에 대 한 DL 측정 장치 내에서 정밀도를 보여준다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Microparticle 콘텐츠</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>낮은</td>
			<td>매체</td>
			<td>높은</td>
		</tr>
<tr>
<td>반경 (nm)를 의미</td>
			<td>331</td>
			<td>161</td>
			<td>188</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 편차 (mm)</td>
			<td>133</td>
			<td>41</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>40.1</td>
			<td>25.2</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: microparticle 반지름의 장치 내에서 정밀. 매우 낮은 microparticle에서 콘텐츠 작은 혈소판 % 미 (%MP)에 기여할 수 있습니다 낮은 microparticle 콘텐츠 샘플에 대 한 가변성을 증가 결과로.
표 4% 미 (%MP)에 대 한 DL 측정의 재현성을 보여줍니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Microparticle 콘텐츠</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>낮은</td>
			<td>매체</td>
			<td>높은</td>
		</tr>
<tr>
<td>%MP (%)을 의미</td>
			<td>4.4</td>
			<td>29.2</td>
			<td>53.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>재현성 (%)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>35</td>
			<td>11.8</td>
			<td>9.4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: % 미 (%MP)에 대 한 동적 빛 분산 (DLS) 측정의 재현성.
선형성 그림 2 쇼 DL 결과 선형, 즉, 직선 샘플의 할당 된 값에 대해 맞는. 7 샘플 다른 microparticle 콘텐츠로 준비 되었다. 높은 (MP7) 및 낮은 (MP1) microparticle 내용과 일치 혈소판 농도 샘플 준비 되었고 중간 샘플 (MPx)를 만들려고 다른 비율에 혼합. Cytometry 앞에서 설명한19 와 DL와 샘플 테스트 및 각 농도에서 %MP 결과 플롯은 입력 및 출력으로. 결정 계수 0.985 발견 했다. 낮은 높은 microparticle 콘텐츠에 대 한 DL 히스토그램의 예는 그림 3A에 표시 됩니다. DLS 결과 cytometry (그림 3B)에 의해 확인 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig2.jpg"> 그림 2 : Cytometry 및 DL 결과의 비교. %MP 사이 선형 관계 Flow Cytometry (입력) 및 결정 (출력), DL 오픈 기호 ○로 표시 하 고 두 개의 샘플에서 원래 DL 데이터는 그림 3에 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig3.jpg"> 그림 3 :를 활성화 하 고 활성화 되지 않은 혈소판 Microparticle 콘텐츠. (A) MP 콘텐츠 활성화 된 혈소판 (파선) DL 결과 비 활성화 혈소판 (실선)에 4%에 비해 57%. 37 ° C의 측정 온도에서 테스트를 수행한 1.06의 플라즈마 점도 설정 x10-3 Pa·s, 및 200-600 kHz 사이 총 강도 설정. (B) (A);과 같이 동일한 샘플의 cytometry 결과 (19위에서 설명한 대로) 흐름 앞으로 분산형 히스토그램에서 P1 및 P2 MP 및 혈소판 게이츠를 각각 나타냅니다; 활성화 된 혈소판에 대 한 이벤트의 (왼쪽된) 76%는 비 활성화 혈소판 (오른쪽)에 대 한 6%에 비해 MP 게이트로 떨어졌다. 선형 회귀선 % MP cytometry 지속적으로 높은 결과, 배경 잡음의 지속적인 상대적 기여도 제안 합니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
특이성/간섭 국제 조직 표준화 (ISO)에 대 한 감지 하거나 다른 수량 샘플에 존재 하는 동안만 measurand 측정 측정 절차의 기능으로 분석 특이성을 정의 합니다. Microparticle 심사의 분석 특이성 적혈구 (RBC)에 의해 영향을 받을 수 있습니다. DLS MP 콘텐츠 혈소판 콘텐츠를 기준으로 측정합니다. RBC 증권의 산란 기여, 혈소판의 산란 기여에 포함 되어 있기 때문에 MP의 상대적 기여도 감소 방해 수 있습니다. 혈액 제품에서 허용 RBC 콘텐츠에 대 한 규제 제한을 존재; 임계값의 보수 변환에 의해 권장 AABB 혈소판 집중 2 mL에 허용 RBC 농도 대 한 RBC 8.0에서 혈소판 결과의 한 단위로 포장 x1010 셀/L (가정: RBC 볼륨은 8.5 x10-14L, 보통 포장된 RBC의 68%, 혈소판 단위의 볼륨은 200 mL). 다른 제품에서 보고 된 잔여 RBC 농도이 임계값46잘 같습니다.
3 다른 기증자는 3 개의 독립적인 실험에 대 한 자격으로 두 개의 다른 일에 혈소판 및 적혈구 (RBC)을 기증 했다. 혈소판 집중 (참조 샘플)에서 초기 RBC 콘텐츠는 0.05-0.15 x109 셀/L는 hemocytometer로 결정. 5 추가 샘플 급상승에 알려진된 양의 RBC 혈소판 농축액; aliquots에 의해 만들어진 이 예제에서 타겟 RBC 레벨은 1.0, 5.0, 10, 40 및 80 x109 셀/l.
적혈구의 간섭 임계값은 약 1.0 x1010 셀/L (그림 4), 또한 수준에서 붉은 혈액 세포의 존재는 시각적으로 분명 (그림 5)와 상관. 이 수준 위의 %MP 과소 평가 시각적으로 레드 샘플-어느 포함 증권 보다는 헤모글로빈의 보고 microparticle 콘텐츠는 너무 낮은 것을 의미.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig4.jpg"> 그림 4 : %MP (DL)와 RBC 농도 (셀/L) 사이 선형 관계. RBC 농도 0.1의 증가 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010및 8.0 x1010 셀/L (왼쪽에서 오른쪽) 3 독립적인 실험 (○ 실험 1, ● 실험 2, □ 실험에서 3, 선형 회귀 라인 표시 됩니다 각 실험에 대 한). 1.0 보다 x1010 증권/L %MP 싼 이끌어 낸다. RBC 포함 샘플의 시각적 모양은 그림 5에 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig5.jpg"> 그림 5 : 샘플 포함 된 RBC의 시각적 모양을. 빨갛게 혈소판의 샘플링 포함 RBC 농도 0.1의 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010및 8.0 x1010 셀/L 왼쪽에서 오른쪽으로. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
정확도 정확도 단일 측정 결과 샘플에 할당 된 진정한 수량 값으로 정의 됩니다. 이 측정 오차 측정 바이어스에 의해 추정 하는 체계적인 구성 요소 및 표준 편차에 의해 견적 하는 임의의 구성 요소에 포함 되어 있습니다. 따라서, 측정 결과의 정확도 진실과 정밀의 조합 이다.
비드 표준 DLS 테스트의 정확도 결정 하기 위해 사용 되었다. 정확도 3-75 %MP 분석 결과의 임상으로 관련 된 범위 내에서 두 개의 농도에서 평가 했다. 참조 비드 혼합물 참조 구슬에는 알려진된 크기와 농도 때문에 알려진된 농도의 샘플을 준비 하 사용 되었다. 따라서, 참조 구슬 샘플 원하는 입자 크기와 농도를 혼합 수 있습니다.
125 nm 반경 가진 표준 폴리스 티 렌 구슬 미를 나타내는 데 사용 되었다 그리고 1.5 µ m 반경 구슬 혈소판을 나타내는 데 사용 되었다. Microparticle 분석 결과의 정확도 약 20%와 50 %MP 콘텐츠 비드 혼합물으로 평가 했다. 표 5와 같이 참조 구슬에 대 한 분석의 인증서에 문서화 입자 반지름 측정된 입자 반지름의 정확도 비교 되었다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">125 nm 구슬</td>
			<td colspan="3">1.5 µ m 비즈</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>분석의 인증서</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>분석의 인증서</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
		</tr>
<tr>
<td>반지름을 의미</td>
			<td>122.0</td>
			<td>113.8</td>
			<td>124.4</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 개발</td>
			<td>4.5</td>
			<td>2.83</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.035</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>이력서</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>2.48%</td>
			<td>2.89%</td>
			<td>2.20%</td>
			<td>3.74%</td>
			<td>4.05%</td>
		</tr>
<tr>
<td>정확도</td>
			<td></td>
			<td>6.70%</td>
			<td>2.00%</td>
			<td></td>
			<td>6.50%</td>
			<td>6.30%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 동적 빛 분산 (DLS) 측정의 정확성. DL에 대 한 크기 비교 혼합물에 125 nm 반경 및 1.5 µ m 반경 구슬에 대 한 분석의 인증서에 대 한 결과.

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Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

혈소판 집중에서 microparticle 콘텐츠 심사에 따라 혈소판 재고 관리 병원 혈액 은행에 새로운 품질 개선 이니셔티브 이다. 활성화 된 혈소판의 사용을 최적화 하기 위해 비 활성화 된 혈소판에서 차별화 하는 목표가입니다. 혈액 종양 환자에 게 제공 하는 비 활성화 된 혈소판 내 화 될 그들의 높은 위험이 줄어들 수 있습니다.

혈소판 수혈에 미에 대 한 메서드를 검사 하는 루틴

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

연구

의학

Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the highest possible level of safety for transfusion patients, including protection from transfusion transmitted diseases. This must be accomplished in a fiscally responsible manner which minimizes operating expenses including consumables, equipment, waste, and personnel costs, among others.
Several methods are available to produce platelet concentrates for transfusion. One of the most common is the buffy coat method in which a single therapeutic platelet unit (&ge; 2.0 x1011 platelets per unit or per local regulations) is prepared by pooling the buffy coat layer from up to six whole blood donations. A procedure for producing "double dose" whole blood derived platelets has only recently been developed.
Presented here is a novel method for preparing double dose whole blood derived platelet concentrates from pools of 7 buffy coats and subsequently treating the double dose units with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. INTERCEPT was developed to inactivate viruses, bacteria, parasites, and contaminating donor white cells which may be present in donated blood. Pairing INTERCEPT with the double dose buffy coat method by utilizing the INTERCEPT Processing Set with Dual Storage Containers (the "DS set"), allows blood centers to treat each of their double dose units in a single pathogen inactivation processing set, thereby maximizing patient safety while minimizing costs. The double dose buffy coat method requires fewer buffy coats and reduces the use of consumables by up to 50% (e.g. pooling sets, filter sets, platelet additive solution, and sterile connection wafers) compared to preparation and treatment of single dose buffy coat platelet units. Other cost savings include less waste, less equipment maintenance, lower power requirements, reduced personnel time, and lower collection cost compared to the apheresis technique.

This article describes the process used by &#214;rebro University Hospital to produce double dose buffy coat platelet concentrates prepared from whole blood donations and treated with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. The in vitro quality of the final platelet units are evaluated over 7 days of storage.

차단 혈액 시스템을 사용하여 준비 및 더블 복용 버피 코트의 혈소판 제품의 병원체 불 활성화

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

콜라겐 - 유도 된 응집에 Pannexin1 억제제의 효과 브릴리언트 블루 FCF : 탁도는 인간 혈소판에 씻어

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

가속도계를 사용하여 일상 생활에서 상지 성능을 정량화하는 방법

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have been limited compounds available so far to attenuate TLR signaling and there have been no clinically approved TLR inhibitors (except the anti-malarial drug hydroxychloroquine) in clinical use. In light of rapid advances in nanotechnology, manipulation of immune responsiveness using nano-devices may provide a new strategy to treat these diseases. Herein, we present a high throughput screening method for quickly identifying novel bioactive nanoparticles that inhibit TLR signaling in phagocytic immune cells. This screening platform is built on THP-1 cell-based reporter cells with colorimetric and luciferase assays. The reporter cells are engineered from the human THP-1 monocytic cell line by stable integration of two inducible reporter constructs. One expresses a secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) gene under the control of a promoter inducible by the transcription factors NF-&#954;B and AP-1, and the other expresses a secreted luciferase reporter gene under the control of promoters inducible by interferon regulatory factors (IRFs).Upon TLR stimulation, the reporter cells activate transcription factors and subsequently produce SEAP and/or luciferase, which can be detected using their corresponding substrate reagents. Using a library of peptide-gold nanoparticle (GNP) hybrids established in our previous studies as an example, we identified one peptide-GNP hybrid that could effectively inhibit the two arms of TLR4 signaling cascade triggered by its prototypical ligand, lipopolysaccharide (LPS). The findings were validated by standard biochemical techniques including immunoblotting. Further analysis established that this lead hybrid had a broad inhibitory spectrum, acting on multiple TLR pathways, including TLR2, 3, 4, and 5. This experimental approach allows a rapid assessment of whether a nanoparticle (or other therapeutic compounds) can modulate specific TLR signaling in phagocytic immune cells.

Toll-like receptor (TLR) signaling plays an important role in the pathophysiology of many human inflammatory diseases, and regulating TLR responses by bioactive nanoparticles is anticipated to be beneficial in many inflammatory conditions. THP-1 cell-based reporter cells provide a versatile and robust screening platform for identifying novel inhibitors of TLR signaling.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Handheld Metal Detector Screening for Metallic Foreign Body Ingestion in Children

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a handheld metal detector to detect ingested metallic foreign bodies in children. We propose that by introducing handheld metal detector screening early in the triage process of children with high suspicion of metallic foreign body ingestion, the number of radiographs being ordered to localize the metallic foreign body can be reduced in this radio-sensitive population. The study protocol requires the screening of the participants for history of foreign body ingestion and exclusion of patients with respiratory distress or metallic implants. The patient changes to hospital gown and items that could contain metal like eyeglasses, earrings, pendants, and ornaments are removed. The patient is positioned in the center of the room away from other metallic interferences. The working status of the handheld metal detector is first confirmed by eliciting a positive audio-visual signal. Then the screening is done in an erect position with head in extension to expose the neck, from the level of the chin to the level of the hip joint, to cover the anatomical areas from neck to pelvis in a zig-zag manner both anteriorly and posteriorly. A positive audio-visual signal is carefully noted during the scanning for the presence of metallic foreign body. Relevant radiographs are ordered as per the area detected on the metal detector screening. The handheld metal detector was able to precisely identify all the coins among the ingested metallic foreign bodies in our study. The handheld metal detector could not consistently detect non-coin metallic foreign bodies. This protocol demonstrates the accuracy of handheld metal detector in the identification and localization of coins and coin like metallic foreign bodies.

Here, we present a protocol to use the handheld metal detector, to screen for the presence of ingested metallic foreign bodies in children who present to the pediatric emergency medicine department with a history of foreign body ingestion.

아이 들에서 금속 이물질 섭취에 대 한 휴대용 금속 탐지기 검사

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...