ניתוח מקיף של טסיות דם מקרישות המציגות מאפיינים של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם

המחקר שלנו מתמקד בהבנת חילוף החומרים והאיתות של טסיות הדם במצבים פרוטרומבוטיים, כגון תסמונת אנטי-פוספוליפידים וסרטן, מתוך כוונה לזהות סמנים ביולוגיים חדשים ומטרות טיפוליות. הקבוצה שלנו הייתה בחזית העלייה האחרונה בעניין לגבי האופן שבו חילוף החומרים של טסיות הדם תורם להפעלת טסיות הדם ופקקת. אפיון מדויק של מצב הפעלת טסיות הדם במחזור הדם של חולים כדי לקבוע את הסיכון לפקקת כמו גם את היעילות הטיפולית של תרופות נוגדות טסיות נותר אתגר משמעותי.

גליקוליזה אירובית, מסלול פנטוז פוספט וחמצון בטא של חומצות שומן נחשפו כמסלולי חילוף החומרים האנרגטי הבולט בטסיות הדם והפוטנציאל שלהם הוכח למיקוד טיפולי. פרוטוקול זה משמש לסייע בזיהוי ואפיון תפקודי מדויק של טסיות פרו-קרישה, להבדיל מטסיות פרו-אגרגטוריות, כמו גם טסיות דם העוברות מוות תאי על ידי אפופטוזיס או נמק. כדי להתחיל, יש להוסיף טסיות דם אנושיות שטופות בסידן של 2.5 מילי-מולרי על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של תמיסת סידן כלוריד מלאי מולארי ל-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם.

שמור על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועורר את החלק הנותר בשילוב של טרומבין ועוויתות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הגירוי, הוסף מיקרוליטר אחד של נספח V, ארז אחד ונוגדנים נגד CD62P ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים. דגרו את הטסיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין לפני ניתוח הדגימות על ידי זרימה ציטומטרית כדי לכמת טסיות פרו-קרישה. להכנת טסיות יש לדלל טסיות דם אנושיות שטופות לריכוז של מיליון טסיות דם למיליליטר ולהוסיף 2.5 מילי-מולרי סידן. סמנו את הטסיות בחמישה ROD2 מיקרו-מולארי לזיהוי סידן מיטוכונדריאלי ודגרו במשך 30 דקות בחושך.

להכנת טסיות לבדיקת הפעלת קספאז, לאחר השלמת טסיות הדם בסידן וגירוי שבריר, הוסף תבנית תיוג קספאז פעילה למתלי הטסיות המגורים. דגרו על הטסיות למשך 30 דקות בחושך. לאחר 30 דקות, תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין לפני ניתוח הטסיות על ידי ציטומטריית זרימה.

התוצאות מראות כי תרומבין גרם לעלייה תלוית מינון בשיעור הטסיות המבטאות הן פוספטידילסרין והן P-סלקטין. גירוי תרומבין גרם גם לעלייה תלוית זמן ברמות הסידן המיטוכונדריאלי בטסיות הדם. עם זאת, גירוי טרומבין הביא להפחתת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בטסיות הדם.

גירוי תרומבין הפעיל קספאז-8 אך לא קספאז-3 או 7 בטסיות.