저의 연구 활동은 대식세포가 AIDS 전염병의 원인이 되는 바이러스인 HIV에 의한 감염에 저항하도록 만드는 메커니즘을 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 특히, 우리는 바이러스 게놈의 구성 요소인 NTP를 분해하는 HT-1이라고 하는 효소의 활성에 초점을 맞춥니다. 그러나 이 효소는 우리가 밝히려고 하는 다른 활동도 가지고 있습니다.
우리는 THP1 세포를 유전적으로 조작하기 위한 프로토콜을 수립했습니다. 이 세포는 인간 대식세포가 연구할 수 있는 잘 확립된 대리물입니다. 예를 들어, HIV-1의 복제가 있습니다.
이러한 세포는 단백질 함량을 조작하기 위해 transfection이 어렵습니다. 따라서 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 그들의 게놈을 조작하는 방법을 확립했습니다. SG RNA의 설계부터 다클론 및 단클론 집단의 검증에 이르기까지.
당사의 프로토콜은 Cas9 뉴클레아제 에너지 RNA에 의해 만들어진 사전 조립된 리보핵단백질 복합체로 전기천공될 THP1 세포의 관심 유전자의 고효율 편집을 달성하는 것을 목표로 합니다. 이 방법에서는 Cas9 활동이 시간이 제한됩니다. 이는 렌티 벡터를 사용할 때 자주 발생하는 표적 효과의 생성 가능성을 줄입니다.
그리고 이 경우, 실제로 Cas9 발현은 시간을 연장시키므로 세포에 손상을 줄 수 있습니다. 먼저 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 항생제 없이 500마이크로리터의 RPMI 1640 배지를 채우고 20% 열 비활성화 및 여과된 FBS를 보충합니다. 플레이트를 가습 인큐베이터에 밤새 넣으십시오.
건조 단일 가이드 또는 sgRNA를 최종 농도인 100마이크로몰로 재수화하려면 sgRNA 1나노몰당 10마이크로리터의 TE 완충액을 추가합니다. 용액을 30초 동안 소용돌이치고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양하여 완전한 수분 보충을 보장합니다. 다음 날, 30 마이크로몰 작동 sgRNA 용액을 준비하기 위해 먼저 피펫으로 100 마이크로몰 스톡 sgRNA 용액을 간단히 균질화한 다음 줄기를 뉴클레아제가 없는 물에 희석합니다.
용액을 30초 동안 볼텍스하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 3개의 30마이크로몰 sgRNA의 작업 용액과 0.5마이크로리터의 20마이크로몰 Cas9 용액을 각각 1마이크로리터의 재부유 완충액 R에 희석하여 Cas9 sgRNA 리보핵단백질을 조립하고 1 대 9의 몰 비율을 추가합니다. Vortex를 잠시 사용하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
편집되지 않은 대조군을 준비하기 위해 0.5마이크로리터의 20마이크로몰 Cas9 용액을 6.5마이크로리터의 재현탁액 R.Vortex에 간단히 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하고 5마이크로리터의 재부유 완충액 R을 샘플에 추가하여 전기천공 조건당 12마이크로리터의 최종 부피를 달성합니다. 세포 계수 후 THP-1 세포를 준비하려면 THP-1 세포 6개의 0.2배의 10배에 해당하는 부피를 수집하고 336G에서 섭씨 20도에서 5분간 원심분리한 후 피펫을 사용하여 상등액을 흡인하고 500마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다시 원심분리기를 하고 12마이크로리터의 리보핵단백질 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
electroporation 시스템을 설정하려면 피펫 스테이션을 생물 안전 캐비닛 아래에 놓고 캐비닛 내부에 electroporation 튜브를 배치하고 electroporation 키트에서 electroporation 튜브로 3ml의 버퍼 E를 추가합니다. electroporation 장치를 켜고 electroporation 매개변수, 전압을 1, 500 볼트에 놓기 위하여 터치스크린을 사용하십시오. 기간을 10밀리초로 설정합니다.
그리고 숫자는 3까지입니다. 전기천공법 피펫에 팁을 장착하고 리보핵단백질 THP-1 용액 10마이크로리터를 흡입합니다. 피펫을 electroporation 튜브에 삽입하고 electroporation 장치 화면에서 시작을 누릅니다.
완료 메시지가 나타날 때까지 기다렸다가 튜브에서 피펫을 제거합니다. THP-1 세포를 예열된 24웰 배양 플레이트의 웰로 옮기고 샘플을 부드럽게 균질화합니다. 플레이트를 가습 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 72시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
전기천공법과 세포 계수 후, 6개의 THP-1 세포의 0.1 곱하기 10에 해당하는 부피를 1.5 밀리리터 튜브로 빼냅니다. 섭씨 20도에서 5분 동안 336G에서 세포를 원심분리하고 상등액을 흡인하기 전에 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 다시 말하지만, 세포를 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 흡인하고 펠릿을 얼립니다.
게놈 DNA를 추출하려면 펠릿을 50마이크로리터의 DNA 추출 용액으로 재현탁합니다. 이를 균질화하고 전체 부피를 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 옮깁니다. 튜브를 소용돌이치고 3초의 펄스를 위해 잠시 원심분리합니다.
튜브를 열 순환기에 넣고 섭씨 65도에서 15분 동안 가열한 다음 섭씨 98도에서 10분 동안 가열합니다. 다음으로, 추출된 DNA를 90마이크로리터의 초순수, 와류 및 원심분리기로 5000G에서 3초 동안 짧게 희석합니다. PCR 프라이머를 초순수에서 최종 농도 10마이크로몰로 희석합니다.
0.2 밀리리터 PCR 튜브에서 PCR 혼합물을 준비합니다. PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 지정된 설정으로 프로그램을 실행합니다. 새로운 0.2 밀리리터 튜브에서 다클론 편집된 모집단의 경우.
17.5 마이크로 리터의 PCR 앰플리콘과 2 마이크로 리터의 E 버퍼 2를 혼합하여 19.5 마이크로 리터의 최종 부피를 만듭니다. Vortex, 용액 및 원심분리기, 대안적으로, 단일 세포 클론을 스크리닝하기 위해 편집된 대조 세포와 편집되지 않은 대조 세포의 PCR 산물을 일대일 비율로 혼합합니다. 헤테로 듀플렉스 형성을 위해 튜브를 열 순환기에 넣고 주어진 프로그램을 실행합니다.
헤테로 듀플렉스 형성 후 튜브에 0.5 마이크로 리터의 T 7 엔도뉴클레아제 1 용액을 넣고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양합니다. 겔 전기영동을 위해 샘플을 준비하려면 5마이크로리터의 T7 엔도뉴클레아제 1 소화 산물 또는 소화되지 않은 PCR 산물을 5마이크로리터의 물과 2마이크로리터의 6개의 xDNA 로딩 염료와 혼합하고 샘플과 크기 래더를 겔에 로드하고 80볼트에서 45분 동안 겔을 실행합니다. EGFP 유전자 자리의 CRISPR Cas9 매개 유전자 편집은 GFP 양성 세포의 급격한 감소를 초래하여 전기천공법 후 7일째까지 90% 이상 감소했습니다.
전기천공법 후 3일째가 되자 전기천공법으로 인한 스트레스로 인해 세포 수가 절반으로 줄었지만 완전한 RPMI 배지에서 7일째에 완전히 회복되었습니다. T7 엔도뉴클레아제 원세라제와 아가로스의 겔 전기영동은 편집된 세포에서 약 75개의 염기쌍 단편이 소실되었음을 입증하여 EGFP 표적 부위의 CRISPR 편집을 확인했습니다.
