이 연구는 건강 연구 (CIHR) 운영 보조금 MOP-123419, 자연 과학 및 엔지니어링 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 418194, 그리고 온타리오 교육부의 연구 및 BH 혁신 초기 연구 수상의 캐나다 학회에 의해 투자 되었다. DGW는 프로토콜의 최적화 및 원고;의 쓰기에, 제시 하는 이미지의 일부를 기여 그는 리버풀 대학에서에서 펌프 못쓰게 교부 금에 의해 투자 되었다. CY는 Vanier 대학원 장학금 및 CIHR MD/PhD 재학에 의해 자금입니다. 자금 지원 기관 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

이 프로토콜에서 설명 된 방법을 사용 이미징 및 고정 셀 및 라이브 셀 접근을 사용 하 여 동적 efferocytic 프로세스의 정량화. 이러한 방식을 일반적으로 고용된 흐름 cytometry 기반 방법23,24에 여러 가지 이점을 제공합니다. 내부 고정 샘플 얼룩의 사용 속도의 더 강력 하 고 정확한 정량화와 efferocytosis의 범위를 제공 한다-실제로, 많은 교류 cytometry 기반 방...

Apoptosis, 또는 프로그램 된 세포 죽음 대부분 다세포 유기 체에서 발생 하 고 그들의 발달 및 항상성1에 대 한 중요 한 높은 규제 생리 적 과정 이다. 정상 세포 회전율 및 배아 개발에 참여 하 고, 이외에 apoptosis 조직에서 감염 되거나 손상 된 세포의 제거를 가능 하 게 하 고 또한 감염, 염증, 암, 응답 하 고으로 의료 개입에 의해 트리거할 수 있습니다. 방사선 치료 또는 스테로이드1등. Apoptotic 세포 노출 "먹고-나" 다양 한 직업 및 비 직업적인 식 세포에 수용 체에 의해 인식 되는 그들의 세포 표면에 신호 총칭 하 여 "efferocytes"로. 이 수용 체의 참여 efferocytosis2,3로 알려진 프로세스를 통해 efferocyte에 의해 통풍 관 및 apoptotic 세포의 저하를 유도 합니다. Phosphatidylserine은 최고의 특징이 먹고-저 운전 efferocytosis 신호. 그것은 일반적으로 apoptosis을 따라서4셀 표면 phosphatidylserine 노출이 막 비대칭 방해 지질 scramblase 활성화와 원형질 막의 내부 자료에 국한 된다. Phosphatidylserine은 성숙한 세포 등 일부 비 apoptotic 세포의 세포 외 표면에 있고 혈소판 활성화. 그러나,이 세포는 하지 "" 나를 안 먹는, 같은 신호 CD47, 그들의 세포 표면5,,67의 존재로 인해 efferocytosed. 노출된 phosphatidylserine efferocytes에 의해 표현 하는 efferocytic 수용 체의 배열에 의해 인식 된다. Phosphatidylserine에이 수용 체의 바인딩을 직접 또는 opsonins의 원조를 통해 활성화 되 나 efferosome8, 막 도약 공포에 apoptotic 세포의 engulfment를 홍보 하는 신호 통로 9 , 10 , 11 , 12.는 efferosome endosomes를 순차적으로 퓨즈와 리소좀, 분자 기계는 efferosome를 시 어 지 다 하 고 저하는 apoptotic 필요한 제공 셀 화물13,14. 일단 저하, apoptotic 세포 유래 자료는 재활용 endosome에 인신 매매-apoptotic 세포 유래 항 원에 면역 응답을 제한 하 고는 apoptotic 세포13에서 영양분의 복구에 대 한 수는 프로세스 15. Apoptotic 세포;의 장애인된 허가에 efferocytosis 결과에 실패 이러한 uncleared 세포는 결국 보조 괴 사를 받 다. 회 저 성 세포 프로-염증 성 cytosolic 내용, 병원 균, 그리고 autoantigens 따라서 감염, 염증, 자기 면역 질병16,17의 연습장 extracellular 환경으로 풀어. 함께, apoptosis와 efferocytosis 죽어가는 및 죽은 세포의 제거를 촉진 하 고 조직의 항상성 유지에 대 한 허용.
Efferocytosis 기본 분자 메커니즘을 조사 apoptotic 세포 통풍 관의 명확한 정량화를 제공 하는 메서드가 필요 합니다. 이 정량화는 다른 글귀와 달리 endocytosis 및 먹어서18,19, efferocytosis 메커니즘 발생할 수 있습니다 하지 증분 통풍 관의 결과로 그대로 목표 셀의 engulfment에서 사실에 의해 복잡 하 게 efferocyte20apoptotic 세포. 여기에 설명 된 프로토콜 설명 생체 외에서 efferocytosis 분석 결과 내 면의 정확한 묘사를 제공 하는 개별 apoptotic 세포의 비 내 면 부분 대 고정 셀의 다양 한 결합 될 수 있다 및 라이브 셀 현미경에 접근 한다. 전통적인 먹어서 분석 추가 항 체 비 내 면 목표, 우리의 방법으로 레이블 하기 위해 실험의 끝에 phagocytic 대상에 특정 라벨 covalently 연결 biotin21 apoptotic 대상으로 다릅니다 , 22. apoptotic 세포 특정 항 체는이 분석 결과에 사용할 수 있는, biotinylation 접근 어떤 단백질 베어링 대상 표시를 허용 하 고 immunostaining 수행 하는 경우에 이차 항 체 분으로 잠재적인 문제를 피할 수 . 특히, 우리는 셀 추적 염료와 biotin 듀얼 얼룩이 있다 apoptotic Jurkat 세포의 준비 개요. 염료를 추적 셀 apoptotic 세포 유래 자료 efferocytosis 중 추적, 표면 biotinylation의 차별에 대 한 허용 하는 반면 efferocytosed apoptotic 세포의 비 내 면 부분에서 내 면화를 허용 합니다. 우리는 또한 문화 및 준비 J774.2 및 THP-1 셀 라인의 murine 인간과 efferocytes로 사용, M2 세포 monocyte 파생에 대 한 기본 셀 efferocytosis, 및 사용에 대 한 Jurkat 세포의 예를 들어 efferocytic 대상으로 설명합니다. 이러한 방법은 다른 세포 선 또는 1 차 셀, 대상 셀 (예: apoptosis, 괴 사 및 necroptosis), 세포 죽음의 어떤 형태를 겪고 그리고 지질 코팅을 통해 apoptotic 세포 시뮬레이션 미크론 크기의 모방에 쉽게 적용할 수 또는 특정 관심의 efferocytic 수용 체에 ligands와 코팅.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 필드23,24에 일반적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 방법 몇 가지 장점이 있습니다. 직접 식 apoptotic 세포 상호 작용, 모두 총 및 비 내 면 apoptotic 세포 물자의 명확한 라벨와 함께 영상으로 efferocytosis의 정량적 측정을 할 수 있다. 또한, pH을 구분 하지 않는 fluorophores의 사용 등 몇 가지 대체 방법을25confounds lysosomal pH에서 FITC와 GFP 형광 억제 혼동 요인 제한 합니다. 마지막으로, 세부 사항에 설명 되지 않은, 하는 동안 이러한 방법을 채택 될 수 있다 transgenes 붙일 표시를 표현 하는 efferocytes를 사용 하 여 또는 후 고정 immunostaining, 신호 분자 활동 및 모니터링의 정량화를 허용 하는 efferocytosis 중 세포 프로세스입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72290-08</td><td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-4</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Macrophage Cell Line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat T Cell Line</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Efferocytosis의 규칙을 공부 apoptotic 세포의 통풍 관을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis를 제어 하는 신호 및 세포 프로세스를 조사 하는 방법을 필요 합니다. 이 정량화 수행 apoptotic 세포 들은 efferocytosed 증분, 따라서 수 정확 하 게 윤곽을 그리 다 잔여 unengulfed 휴대 대 apoptotic 대상의 efferocytosed 부분 사이 방법이 필요로 하기 어려울 수 있습니다. 파편. 여기 설명 된 방법은 이중 라벨 접근 efferocytosis와 efferocytic 용량의 efferocytes 대 식 세포 등의 역학을 정확 하 게 계량을 활용 합니다. Apoptotic 세포의 cytosol apoptotic 세포의 표면 biotinylation 내 면 및 비 내 면 간의 차별화에 대 한 허용 하는 동안 모든 apoptotic 세포 유래 물질의 모니터링을 활성화 하는 셀 추적 염료와 함께 표시 됩니다. apoptotic 세포의 분수 Efferocytes의 efferocytic 용량 라이브 또는 고정 셀의 형광 이미지와 streptavidin 얼룩으로 구분으로 대 내 면된 대상, 바운드의 양을 측정 하 여 결정 됩니다. 이 방법은 cytometry, 즉 비-efferocytosed 대 efferocytosed apoptotic 세포 분수, efferocytic 역학 라이브 셀 현미경으로 측정 하는 능력의 정확한 묘사 같은 방법에 비해 몇 가지 장점이 고 용량을 붙일 레이블 transgenes 표현 하는 세포에 세포 신호의 연구를 수행 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법, efferocytic 활동을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis 동안 활성 세포 신호 경로 심문 하는 데 사용할 수 있는 유연한 실험적인 접근 방식 기반으로 제공 합니다.

밤새 Jurkat 세포의 apoptosis에 1 µ M staurosporine 결과 문화 > Annexin v (그림 1) 얼룩 확인 될 수 있다 세포의 95%. 비록 staurosporine의 농도 및 staurosporine 치료 기간 각 셀 라인에 대 한 최적화 될 필요가 있을 것 이다 다른 세포 유형,이 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 검색 및 efferocytosis의 정량화에 대 한 > 세포의 80%는 efferocytes에 그들을 추가 ?...

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K 조회수.  University of Western Ontario. Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

생물학

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

신경과학

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

요약

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대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석