이 작업은 Max Planck Society에서 지원했습니다.

1. Electro-competent V. parahaemolyticus 세포의 준비 및 형질 전환 체 세포의 전기 영동 참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 electro-competent 세포의 준비 및 수영 세포에 플라스미드 DNA의 electroporation을 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 형광 단백질이 플라스미드로부터 정상적으로 발현되는 경우 중요합니다. <ol><li> 37 ° C에서 밤새 100 μg / ML 암피실린과 부화가 포함 된 신선한 LB 한천 플레이트에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 V.의 parahaemolyticus 세포를 스트레칭. </li><li> 다음날, V. parahaemolyticus 의 단일 식민지로 LB 배지 200 ML을 접종하고 OD 600 이 1.0에 도달 할 때까지 흔들어주는 조건하에 37 ° C에서 배양합니다. 보통 세포 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하기 위해 5 ~ 6 시간의 배양이 필요합니다. </li><li> 즉시 얼음과 퍼프로 세포를 옮긴다.얼음과 4 ℃ 사전 냉각 원심 분리기에서 모든 추가 단계를 수행하십시오. </li><li> 4 ℃에서 10 분간 2,000 x g에서 세포 수확. </li><li> decantation하여 상등액을 버리고 얼음 - 차가운 273 MM 자당 솔루션 (산도 7.4, KOH로 버퍼링) 25 ML의 세포 펠렛을 다시 일시 중단합니다. </li><li> 4에서 다시 세포를 수확 2000 x 10 분 10 분. 두 번 더 반복하십시오. </li><li> 얼음 추위 273 MM 자당 솔루션 400 μL에 씻어 셀 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이어서 글리세롤을 15 % vol / vol의 최종 농도로 첨가한다. 세포는 이제 electroporation을위한 준비가되어 있지만 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 70 μL의 일정량으로 동결 될 수 있습니다. </li><li> electroporation 들어, 플라스미드 DNA의 100 ~ 1,000 NG와 electro-competent 세포의 70 μL 나누기를 섞어 얼음처럼 차가운 electroporation cuvette (0.2 cm 전극 간격)에 혼합물을 전송하십시오. 25 μF, 2400 V 및 200 Ω 설정으로 전기 천공을 수행하십시오. </li><li> 일시 중지LB broth의 600 μL에 electroporation 큐벳의 세포, 2 ML 튜브에 전송하고 3 시간 37 ° C에서 떨고있는 동안 품어. </li><li> 5 분 2,000 XG에서 세포를 스핀하고 LB 국물의 100 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 필요한 항생제가 들어있는 선택적인 LB 한천 플레이트에 세포 현탁액을 퍼 내고 밤새 37 ° C에서 품을 수 있습니다. </li><li> 다음날 식민지 형성에 대한 접시를 확인하십시오. 자라는 콜로니는 플라스미드에 코드화 된 올바른 항생제 내성 유전자를 가지고 있으며 이제 더 많은 실험에 사용될 수 있습니다. </li></ol> 2. Swarmer 세포 분화의 유도 주 : 다음 단계는 V.parahaemolyticus의 분화 세포 수명주기로의 분화 를 유도하는 방법과 고체 표면에서의 증식을 자극하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 뭉툭한 판을 준비하기 위해 심장 주입 (HI) 한천 4 g을 100 mL ddH 2 O에 현탁하십시오. </li><li>조심스럽게 마이크로파에서 HI 한천 용액을 끓여서 분말이 용해 될 때까지 때때로 병을 흔든다. 121 ℃에서 20 분간 오토 클레이브한다. </li><li> 고압 증기 멸균 후, HI 한천을 60-65 ° C로 냉각시킵니다. 50 μM (100 % 에탄올 중 50 mM의 원액)의 최종 농도로 2,2&#39;- 비 피리 딜을 첨가한다. 4 mM의 최종 농도 (ddH 2 O에서 4 M의 원액)에 CaCl 2 를 첨가한다. 필요한 경우 플라스미드를 유지하기 위해 항생제를 용액에 첨가하십시오. 참고 : 유도 성 플라스미드를 사용하려는 경우 유도제를 최종 농도에 첨가하십시오. 주의 : 2,2&#39;- 바이 피리 딜 : 급성 독성 (경구, 피부, 흡입). 이 화학 물질을 취급 할 때는 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. </li><li> 둥근 150mm 배양 접시에 최종 HI 한천 솔루션 30 - 35 ML을 부어하고 한천이 고형하자. </li><li> 세포 배양 물을 발견하기 직전에 적어도 10 분 동안 37 ℃에서 한천 평판을 말린 다음 (또는 액체 잔류 물이 disa를 가질 때까지)ppeared하지만 더 이상은 아닙니다) 열린 뚜껑이있는 오른쪽 위. 참고 : 건조 시간은 사용 된 인큐베이터에 따라 크게 달라지며 건조 된 판은 V.parahaemolyticus의 덤불을 허용하지 않습니다. (이 단계는 매우 중요합니다!) 플레이트는 신선한 상태로 사용해야하며 2 ~ 3 시간 이상 경과되어서는 안됩니다. 오래된 플레이트는 너무 마르기 때문에 떼 지어 모이게됩니다. </li><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. OD 600 = 0.8이 될 때까지 37 ° C에서 흔들어주는 배양 물을 배양하십시오. 보통 2-3 시간 정도 걸립니다. 그 후에, 세포는 HI 떼 지어 다니는 한천 플레이트에 얼룩을지게 될 준비가되었습니다. </li><li> HI agar swarming plate ( 그림 1A )의 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓습니다. </li><li> 현장을 말리십시오 ( 그림 1B ). </li><li> 플레이트를 투명한 플라스틱 테이프로 밀봉하고 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 밤새 배양하는 동안 분리 될 수 있습니다 ( 그림 1C ). 참고 :인감이 완벽하다는 점이 매우 중요합니다. 공기 방울이 형성되는 것을 피하고 테이프를 적용 할 때 접 힙니다. </li><li> 24 ° C 밤새 플레이트를 품어. 이것은 군집 (swarm-colony)의 주변에서 뻗어 나온 떼 지어 발적과 함께 V. parahaemolyticus 군집 (swarm-colony)의 형성을 초래할 것이다 ( 그림 2 ). </li></ol> 3. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비 참고 : 다음 프로토콜은 현미경에 대한 단일 swarmer 세포를 얻기 위해 아가로 오스 패드에 득실 거리는 플레어의 현미경 아가로 오스 슬라이드 및 후속 임 프린팅을 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 현미경 검사를 위해 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 20 % vol / vol PBS와 10 % vol / vol LB broth 용액 100 mL에 1 g의 아가로 오스를 첨가하십시오. 조심스럽게 전자 레인지에서 용액을 끓여 아가로 오스를 녹이고 자기 교반기로 혼합하면서 65-70 ° C로 식히십시오. </li><li> 장소 AC기울기를 가진 현미경 슬라이드를 작업대의 완벽하게 수평 부분에 올려 놓습니다. 슬라이드의 양쪽 끝을 범용 실험실 라벨 테이프로 덮고 슬라이드를 작업대에 고정시킵니다. 두 테이프 사이의 거리는 약 3cm가되어야합니다. 참고 : 테이프의 두 레이어는 아가로 오스 패드의 높이를 결정하는 매우 작은 높이를 만듭니다. 세포가 현미경 분석을 위해 동일한 평면에 있는지 확인하기위한 작업 공간의 높이는 중요합니다. </li><li> 이전에 준비한 아가로 오스 용액 250 μL을 피복되지 않은 유리 표면에 피펫 팅하십시오. </li><li> 이제 두 번째 현미경 슬라이드를 아래쪽 상단과 동일한 방향으로 놓고 약간 아래로 눌러 잔여 아가로 오스가 측면으로 흘러 나오도록하십시오. </li><li> 아가로 오스가 1 ~ 2 분 동안 고형화되도록 한 다음 천천히 상단 유리 슬라이드를 수평 이동으로 하단 유리에서 빼냅니다. </li><li> 메스를 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하십시오.현미경 슬라이드의 측면과 천천히 현미경 슬라이드의 끝 부분에서 테이프를 제거합니다. 참고 : 아가로 오스 슬라이드는 이제 준비가되었으며 천천히 건조하기 시작하므로 최대한 빨리 사용해야합니다. </li><li> 스머머 세포에서 현미경 검사를 수행하려면 떼 지어 서식하는 콜로니 ( 그림 1D )의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 ~ 3mm x 10mm의 무리한 한천 조각을 잘라내십시오. 스 마머 셀을 현미경 슬라이드로 옮기기 직전까지 떼 지음 판의 테이프 씰을 끊지 않는 것이 매우 중요합니다. 일단 테이프가 제거되면, V. parahaemolyticus의 떼죽음 세포가 수영 세포로 분화를 시작합니다. 참고 : 떼 지어 서식하는 모서리 바깥 쪽에서부터 식민지 안쪽까지 컷을 향하게하십시오 ( 그림 1D ). 이런 식으로 당신은 군집하는 식민지의 가장자리로 &quot;헤엄 치는 사람 오염&quot;을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 아가로 오스 PA를 마주보고 현미경 아가로 오스 슬라이드에 무리 한천의 조각을 전송d ( 도 1E ). 이것은 덤불 세포를 아가로 오스 패드 위에 각인시킵니다. </li><li> ~ 30 초 기다린 후, 아가로 오스 패드 ( 그림 1F )에서 한천 조각을 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 세포가 각인 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 현미경 검사를 할 준비가되었습니다. 참고 : swarmer 세포가 수영 선수 상태로 천천히 분화를 시작하기 때문에 swarmer 세포를 즉시 이미지화하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus 수영 세포 배양의 준비 참고 : 프로토콜의이 섹션은 수영 세포 유형에 형광 현미경 검사 를 수행하기 위해 V.parahaemolyticus의 문화를 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. 37 ° C에서 1 시간 동안 또는 약간의 세포 성장이 보일 때까지 흔들어주는 배양 물을 인큐베이션한다. </li><li> 에서필요한 경우이 단계에서 관심 단백질의 발현 유도제를 추가합니다. 이 실시 예에서, L- 아라비 노스는 YFP-CheW 9의 발현을 유도하기 위해 0.2 % (w / vol)의 최종 농도로 첨가되었다. </li><li> 37에서 추가 2 시간 동안 흔들어 문화를 품어 ° C. </li><li> 현미경 검사 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 3.1-3.7 단계를 수행하십시오. </li><li> 아가로 오스 패드 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓고 마를 때까지 배양하십시오. </li><li> 세포가 발견 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미징 준비가되었습니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 프로토콜의이 부분은 이미지 분석을위한 작업 흐름, 특히 인구 통계 학적 분석을 위해 단일 셀의 형광 데이터를 추출하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 이미지 분석을 시작하기 전에 모든 현미경 이미지가 16 비트 TIF 형식으로 저장되었는지 확인하십시오. </li><li> DIC (또는 위상차) 및 해당 형광 채널 이미지를 소프트웨어에로드하십시오. </li><li> &quot;디스플레이 / 오버레이 이미지&quot;를 선택하여 두 채널의 오버레이 이미지를 생성하십시오. 사진 수 ( &quot;# Images :&quot;)를 2로 설정하고 첫 번째 채널의 DIC 이미지와 두 번째 채널의 형광 이미지를 선택하십시오. </li><li> 툴바에서 &quot;Multi-Line&quot;도구를 선택하고 셀 가운데를 통해 한 극에서 다른 극으로 셀을 표시하십시오. 생성 된 모든 선 (선 객체)의 목록을 가져 오려면 &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 엽니 다. 영역 레이블, 거리 및 평균 강도 만 표시하도록 영역 측정을 구성하십시오. </li><li> &quot;Measure / Calibrate Distance&quot;아래의 픽셀 크기를 현미경 설정에 맞는 픽셀 크기로 조정하고 &quot;열려있는 모든 이미지에 적용&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 모든 영역 (라인 객체)을 형광 채널 이미지로 전송합니다. &quot;지역 / Transf영역 &quot;에서 소스 이미지 (오버레이 이미지)와 대상 이미지 (형광 채널 이미지)를 선택하고&quot;All Regions &quot;를 선택하고&quot;OK &quot;를 누릅니다. 참고 : 정확한 선 (선 객체, 지역, ROI)을 나중에 다시 생성하려면 &quot;영역 / 영역 저장&quot;을 열고 영역을 저장하십시오. </li><li> &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 열고 &quot;로그 열기&quot;를 눌러 모든 지역 측정 값을 스프레드 시트로 내 보냅니다. 데이터를 열고 내보내려면 확인하십시오. 스프레드 시트가 백그라운드에서 열리면 마침내 &quot;F9 : 데이터 기록&quot;을 눌러 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 셀을 따라 형광 초점의 위치를 ​​결정하려면 &quot;Measure / Linescan&quot;을 엽니 다. 셀의 전체 너비가 이전에 만든 영역으로 덮여 지도록 &quot;선폭&quot;을 값으로 설정합니다. 라인 스캔 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &quot;그래프 데이터 표시&quot;를 선택하십시오. 라인 - 스캔을 따라 마우스 - 커서를 마우스 왼쪽 - 클릭하고 끌어서&quot;Graph Data&quot;창에는 두 지점 사이의 해당 픽셀 / 거리가 표시됩니다. 파란색으로 강조 표시된 행을 선택한 다음 내용을 복사하십시오. 참고 : 전체 라인 스캔 강도 프로파일은 &quot;라인 스캔&quot;창에서 &quot;로그 데이터&quot;를 눌러 스프레드 시트에 기록 할 수 있습니다. 추출 된 데이터는 이제 그래프 또는 추가 통계 분석에서 시각화에 사용할 수 있습니다. 세포주기에 걸친 현지화 패턴은 세포체와 세포의 길이에 따른 인구 통계 학적 표현으로 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 이러한 표현은 이전에 선택된 동일한 투자 수익 (ROI)을 사용하여 얻을 수 있습니다. 다음 단계는 그림 3C 및 4C에 표시된 것과 유사한 인구 통계를 생성하는 방법의 예를 제공합니다. <ol><li> &quot;Metamorph nd &amp; ROI 파일 임포터&quot;를 사용하여 소프트웨어 (단계 5.6)에서 이전에 생성 된 피지 / ImageJ로드 영역 표시 (.rgn); 또는 분석 할 셀의 관심 영역 (ROI)을 빌드 인 &quot;세그먼트 선&quot;도구를 사용하여 Fiji / ImageJ에서 직접 만들 수 있습니다. </li><li> &quot;Analyze / Tools / ROI manager&quot;를 열고 모든 활성 목록 항목을 표시하십시오. &quot; </li><li> 그런 다음 &quot;More / Multi Plot&quot;을 클릭 한 다음 새로운 &quot;Multi Plot&quot;창에서 &quot;List&quot;를 선택하십시오. 표 항목을 클릭 한 다음 &quot;모두 복사&quot;를 선택하십시오. 그런 다음 새 스프레드 시트에 붙여 넣습니다. 참고 : 스프레드 시트에서 가장 긴 셀 (가장 많은 행이있는 두 개의 해당 X 및 Y 열)이 마지막 것임을 확인하십시오. </li><li> 스프레드 시트를 &quot;CSV (쉼표로 구분) (* .csv)&quot;로 저장하십시오. </li><li> 여기에서 R 스크립트를 다운로드하십시오. &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;10. 스크립트는 길이별로 세포를 분류하고 모든 세포의 형광 강도 프로파일을 각 세포의 형광등의 평균으로 정규화합니다이자형. </li><li> 전체 스크립트 &quot;cell profiles function.R&quot;을 R [버전 3.0.1; 11 ]. </li><li> 30 번째 줄에있는 &quot;예제 plots.R&quot;스크립트를 편집하여 파일 경로가 이전에 생성 된 .csv 파일이 저장된 폴더를 참조하도록합니다. 또한 31 행의 &quot;profile.csv&quot;파일 이름을 5.9.4 단계에서 생성 한 .csv 파일에 대해 선택한 파일 이름으로 변경하십시오. 그런 다음 &quot;example plots.R&quot;을 실행하고 스크립트 파일의 설명뿐만 아니라 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;의 설명서를 따라 인구 통계 분석을 생성하십시오. </li></ol></li></ol>

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아무런 이해 상충이 없다고 선언했다.

이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 14 , 15 , 16 , 17 , <sup class="x...

박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지 주요 변화를 포함한다 : 세포 분열의 억제를 통한 swarmer 세포 형태 형성 및 두 번째 편모 계의 유도. 그 결과 분열이 일어나고 매우 길어진 봉 모양의 swarmer 세포가 형성되는데, 분열 현상은 분열 현상을 일으켜 자손 swarmer 세포가되거나 swimer 세포로 다시 분화된다. swarmer differentiation을 유도하거나 영향을 미치는 몇 가지 요인이보고되었다. 1 차 자극은 V. parahaemolyticus 가 표면 편에 회전의 억제를 감지하는 촉각 센서로 극모를 사용하는 메토 노 센싱 (mechanosensing) 에 의해 구동되는 것처럼 보이지만 몇 가지 다른 요인이우물 1 . 연구실에서는 북극 편모의 회전이 phenamil의 첨가에 의해 인위적으로 억제 될 수 있는데, 이는 나트륨 채널 구동 편모의 회전을 차단하여 스머머 분화를 유도한다. 또한, 초기 연구에서, Vibrio alginolyticus 는 투명한 플라스틱 테이프로 봉인 된 페트리 접시의 성장 배지에서 세포가 증식 될 때 고체 배지에서 떼 지어 유도되었다. 알칼리가 포화 된 여과지는 이러한 조건에서 휩쓸 기를 방지하여 하나 이상의 휘발성 산이 휩쓸 기의 유도에 관여 할 수 있음을 암시합니다. 따라서, 페트리 접시를 플라스틱 테이프로 밀봉하면 판의 헤드 공간 내에 세포 대사의 부산물로 형성된 휘발성 산이 축적 될 가능성이 높습니다. H2O2를 밀봉되지 않은 배양 접시에서 성장 배지에 첨가하여 배지 성분을 가수 분해하여 휘발성 산을 인위적으로 생산할 때도 동일한 효과가 나타났다 <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . 그럼에도 불구하고 그러한 휘발성 산의 정체는 알려지지 않았습니다. 또한, 칼슘 6 과 철 제한 7 의 과도한 가용성은 모두 고체 표면보다 스와머 분화 및 증식을 강화시키는 것으로 나타났습니다. 세포는 화합물 2.2&#39;-Bipyridyl을 swarmer differentiation 8 에 영향을 미치는 것으로 보이는 성장 배지에 첨가함으로써 철분을 굶어 죽을 수있다. 분화를 조절하는 것으로 알려진 인자는 현재 스와머 세포로의 비장 세포 분화를 유도하고 고체 한천 표면에서 그의 증식을 재현 가능하게 유도하는 프로토콜의 설계에서 실행된다. 베로니카 parahemolyticus 의 분화는 세포 분열의 조절, 세포 형태 및 깃대와 같은 거대 분자 기계의 위치의 주요 변화를 포함한다화학 주성기구 (chemotaxis apparatus) - 세포주기에 따라 단백질의 특정 위치를 요구하는 과정. 따라서, 그러한 단백질의 세포 내 국지화를 연구하는 능력은 전술 한 세포 과정의 이해에 필수적이다. 이러한 연구를 수행하기 위해서는 단일 세포에서 형광 현미경 검사가 필요합니다. 이것은 swarmer 세포의 경우처럼 밀도가 높은 세균 집단 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 현미경 연구를 위해 잠재적으로 단일 세포를 생성 할 수있는 액체 배지에서 스머머 분화를 유도하려는 시도가 있었다. 그리고 전사 수준에서이 세포들은 부분적으로 swarmer-differentiation 프로그램을 유도하지만 고체 배지에서 완전히 분화 된 swarmer 세포와 동일한 형태 학적 변화를 겪지는 않습니다 8 . 이 논문은 강력하고 재현성있는 방법을 제안한다.한천 표면의 차별화. 이 프로토콜은 단일 셀 현미경 검사 및 후속 분석을 위해 쉽게 접근 할 수있는 스머머 세포 집단을 쉽게 생성합니다. 또한, 프로토콜은 수영과 swarmer 세포 유형 (섹션 1, 2, 3, 4) 모두에서 형광 라벨 단백질의 현지화 연구를 가능하게합니다. 또한이 프로토콜은 박테리아 사회의 인구 통계 학적 분석을 가능하게하는 형광 현미경 실험에서 생성 된 데이터를 처리하고 분석하는 방법에 대한 후속 작업 과정을 설명합니다 (섹션 5).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>For preparation of LB agar with LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra quality</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>For preparation of microscopy agarose pads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Used to induce pBAD derivatives</td></tr><tr><td>2,2`-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>-</td><td>-</td><td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>D(+) Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hardware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 mm x 20 mm with cams</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus</td><td>-</td><td>Used for drying HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Used for microscopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Used for microscopy data analsis</td></tr></tbody></table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.

맹목적인 식민지의 분화 및 생성 유도 그림 1 은 V. parahaemolyticus ( 그림 1A-C )의 군집 콜로니 생산에 관련된 중요한 단계의 스키마를 제공합니다. Swarmmer 한천 배지를 24 ℃에서 배양하여 고형 한천 표면에서 스머머 분화 및 증식을 유도 하였다. 떼 지어 서식하는 콜로니의 대표적인 입체 현미경 이?...

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K 조회수.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다. 

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Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

연구

유전학

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

면역학 및 감염병학

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

생화학

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

생체공학

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

생물학

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도

요약

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