우리의 연구는 암세포를 죽이는 데 자연적으로 효과적인 면역 세포 유형에 의해 생성되는 작은 소포에 초점을 맞추고 있습니다. 이 소포는 뇌와 같은 1차 및 2차 부위 모두에서 고형 종양을 치료할 수 있는 유망한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구에서는 바이모달 수지를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 통해 소포를 분리하고, 오염 물질로부터 소포를 물리적으로 분리하여 제품 순도를 극대화하는 동시에 정전기력을 통해 수지 내부의 오염 물질을 추가로 가두었습니다.
그런 다음 사용하기 전에 소포를 살균, 농축 및 완충 교환합니다.이 비디오의 바이오제조 워크플로우 세부 정보는 임상적으로 관련된 조건을 사용하며 비용 대비 확장 가능하여 대량의 고순도 세포외 소포체를 효과적으로 생산할 수 있습니다. 이를 통해 학술 실험실에서 신뢰할 수 있는 생산 및 분리 프로세스를 통해 이러한 치료법을 연구하는 데 자신 있게 자원을 투자할 수 있는 기술에 액세스할 수 있습니다. 우리는 현재 이러한 소포 및 전임상 모델의 치료 가능성을 조사하고 있으며 이러한 작용 방식에 대한 이해를 더욱 강화하고 있습니다.
먼저 제조업체의 지침에 따라 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템 시작을 수행합니다. 드립-투-드립 방법을 사용하여 컬럼 내부에 공기가 유입되지 않도록 연결합니다. 시료를 채취하기 위해 적절한 채취 튜브가 있는 분획 분취기를 설치합니다.
분획 설정을 원하는 분취량으로 변경합니다. 섭씨 80도의 냉동고에서 이전에 준비된 세포 외 소포체 또는 EV가 풍부한 컨디셔닝 배지 40-80ml를 제거하고 섭씨 37도에서 빠르게 해동합니다. 10, 000 G에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 표본을 회전시키고 새로운 관으로 상등액을 옮기십시오.
이중 가닥 DNA 수준을 줄이려면 EV가 풍부한 컨디셔닝 배지를 5밀리몰의 염화마그네슘과 50밀리리터의 엔도뉴클레아제로 처리합니다. 적당히 혼합하여 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 샘플을 배양합니다. 크로마토그래피 시스템이 준비되면 EV가 풍부한 컨디셔닝 배지를 60ml 주사기에 로드하고 샘플 라인에 연결합니다.
Manual Run(수동 실행)을 클릭하여 시스템을 시작하고 유량을 0으로 설정합니다. 소프트웨어 지시에 따라 실행을 선제적으로 저장합니다. 그런 다음 시작을 클릭합니다.
Line Beat Double-Filtered PBS를 선택하고 분당 2밀리리터의 유속으로 실행하여 용액이 컬럼을 통과하도록 합니다. 흡수제가 안정화되면 Auto Zero UV를 누릅니다. 유동 경로를 변경하여 샘플이 컬럼 앞의 폐기물 병으로 향하도록 합니다. 5-20초 후에 샘플을 컬럼으로 보냅니다.
UV 판독값이 약 230밀리 흡수 단위에 도달하면 Fractionation(분획)을 클릭합니다. 시료 주입이 완료되면 완충액 시스템을 Double-Filtered PBS로 전환하여 정제를 계속합니다. UV 값이 약 1, 600 밀리흡광도 단위에 도달하면 다시 분획을 클릭합니다.
실행이 중지되면 크로마토그램을 PDF 문서로 저장합니다. 한외 여과 장치의 모든 구성 요소를 20-30 밀리리터의 90 % 에탄올로 헹굽니다. 4, 000G에서 5-10분 동안 회전하고 흐름을 버립니다.
그런 다음 멸균 PBS로 헹굼을 수행하여 장치의 평형을 이루고 이전과 같이 원심분리 단계를 반복합니다. NK-EV의 희석된 분획을 모두 조합합니다. 멸균성을 최대화하려면 이중 여과된 PBS로 미리 적신 0.22마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 희석된 NK-EV 용액을 여과합니다.
여과액을 멸균된 농축 장치에 모으십시오. 여과액을 4, 000G에서 15-40분 동안 회전시킵니다. 회전 후 혈청학적 피펫을 사용하여 상단 필터 구획 내에서 용액을 혼합합니다.
다시 4, 000G에서 10분 동안 돌립니다. 여과 장치를 뒤집어 수집 장치에 부착하여 NK-EV를 회수합니다. NK-EV를 2, 000G에서 2분 동안 회전시키고 정제된 제품을 멸균 튜브로 옮깁니다.
제조업체의 지침에 따라 나노 입자 추적 분석 시스템을 시작합니다. 플로우 셀에서 기포가 있는지 관찰합니다. 기포가 있는 경우 플로우 셀을 20% 에탄올과 이중 여과된 물로 헹궈 제거합니다.
깨끗해지면 레이저 모듈을 나노 입자 추적 분석 기기에 조심스럽게 다시 삽입합니다. 도어를 닫고 카메라 시작을 클릭합니다. 캡처 설정을 화면 게인 2와 카메라 수준 14로 변경합니다.
히터를 켜서 플로우 셀의 온도를 안정화합니다. 표준 측정을 클릭하여 SOP 탭 아래에 섭씨 23도에서 30의 유속으로 1분 동안 하나의 캡처를 수집하는 스크립트를 만듭니다. 경로 이름에 폴더와 파일 이름을 추가하여 데이터를 저장합니다.
정제된 NK-EV 제품을 Vortex하고 이중 여과된 PBS를 사용하여 희석을 준비합니다. 희석된 시료를 와류로 회전시킨 후 기포 없이 1ml 수집 주사기에 로드합니다. 주사기를 기기 로딩 라인에 조심스럽게 연결합니다.
샘플의 절반을 천천히 밀어 주사기에 약 0.5ml를 남깁니다. 입자가 화면에 표시되면 각 입자 주위에 최대 하나의 후광이 있도록 카메라의 초점을 맞추고 하드웨어 탭에서 주입을 클릭하고 5초 동안 1, 000의 속도를 설정합니다. 그런 다음 비율을 30으로 낮춥니다.
스크립트 실행을 누릅니다. 설정이 올바른지 확인한 후 예를 클릭하고 소프트웨어 프롬프트를 따릅니다. 캡처를 완료한 후 소프트웨어가 파일을 처리하거나 내보내도록 요청하면 취소를 클릭합니다.
희석당 5개의 캡처를 기록한 후 분석을 위해 5개의 캡처를 모두 가져옵니다. 파일을 강조 표시하고 선택한 파일 처리를 클릭합니다. 프로세스 탭에서 분석 설정을 화면 게인 2와 감지 임계값 15로 조정합니다.
분석을 위해 확인을 선택하고 클릭합니다. 처리 후 추가 상자를 클릭하지 않고 예를 클릭하거나 내보내기를 클릭하여 파일을 내보냅니다. 정제된 NK-EV 입자 크기는 76.30에서 174.30나노미터 범위였으며 평균 농도는 1.39 곱하기 10에서 밀리리터당 12EV 출력이었습니다.
또한 형광측정기 정량화는 밀리리터당 약 300mg의 단백질 농도와 밀리리터당 225mg의 이중 가닥 DNA 농도를 보여주었습니다. NK-EV를 사용한 인간 K562 백혈병 세포 치료는 9.33 곱하기 10의 EC 50에서 밀리리터당 9개의 EV 거듭제곱으로 용량 의존적 세포 생존율 감소를 보여주었습니다.
