S.R. 발리는 유럽 연합에 의해 Cancro (AIRC) 공동 투자 라 검색 술 당 예술 우승에 의해 친교에 의해 지원 되었다. 또한,이 프로젝트 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 아무 660200 (S.R. 발리) 받았습니다.

중간 엽 줄기 세포 분리에 대 한 인간의 지방 조직 기관 윤리 위원회에 의해 승인 후 Tergooi 병원 (쉼, 네덜란드)의 성형 수술의 부서에서 얻은 고 서 면 통지 해준 동의. GFP-긍정적인 많은 MSCs는 어린이 성인 (모 데 나 대학와 레지오 에밀리 아)에 대 한 부의 의료 및 외과 과학에서 얻은 했다.
동물 실험, 동물 실험에 네덜란드 법률에 따라 수행 하 고 프로토콜 VU 대학 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드의 동물 실험에 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 세포 외 소포 종양 분 비의 격리.
<ol><li>FBS 70000 x g 하룻밤 사이에 (16 시간), 초 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 아무 브레이크 centrifuging EV 고갈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 준비 (기대 감속에 대 한 1 시간). 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (EV 고갈 FBS)를 수집 합니다. 0.22 μ m 필터 EV 고갈 FBS를 필터링 합니다.</li>
	<li>Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2mm 글루타민을 보완 하 여 EV 고갈 문화 매체를 준비 (1 x P/S/G) 및 5% FBS EV 고갈.</li>
	<li>175 cm2 플라스 크에 3 x 106 143B 셀 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 EV 고갈 문화 매체에 문화. 셀 (일반적으로 48 h 36 h) 후 80-90% 합칠 때, EV 격리는 상쾌한 8 x 175 cm2 플라스 크 (28 mL/플라스 크)에서 수집 합니다.</li>
	<li>미리 다음 프로토콜에 따라 차등 원심 (말합니다 때마다 상쾌한 centrifuging)에 의해 세포 및 세포 잔해를 제거 하려면 셀 상쾌한 취소:<ol>
<li>10 분 동안 500 x g에서 두번 상쾌한 원심</li>
		<li>2000 x g 15 분에 두 번 상쾌한 원심</li>
		<li>10000 x g 30 분에 두 번 상쾌한 원심</li>
		<li>최대 가속 및 감속 속도 설정으로 4 ° C에서 모든 centrifugations를 수행 합니다. 각 단계 후 신중 하 게 포함 하는 EV 상쾌한, 약 1 mL를 남겨두고 수집 합니다. 1.5 또는 상점을 사전 허가 조건-80 ° C에서 매체 EV 절연까지 바로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사전 허가 조건된 매체 한번 70000 x g 1 h에서 centrifuging 여 EVs를 격리, 천천히 브레이크, 울트라 진동 물통 회전자를 사용 하 여 울트라 원심 분리기 튜브 (최종 볼륨 38.5 mL/튜브)에 4 ° C에서.</li>
	<li>신중 하 게 나머지 볼륨에 뒤에, resuspend 약 1 mL EV 포함 된 펠 릿을 떠나 상쾌한 제거, 1 개의 ultracentrifuge 관에 모두 수영장 및 완벽 한 튜브 작성까지 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 (최종 볼륨 38.5 mL).</li>
	<li>브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 다시 한번 원심 분리기 (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 100-200 µ L을 남겨두고.</li>
	<li>Resuspend EV-펠 릿을 PBS (모든 EV-격리에 대 한 표준화)와 200 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 즉시 EV 준비를 사용 하거나 사용22까지-80 ° C에 저장 합니다. 참고: EVs 저장 될 수 있다-80 ° c.에 6 개월</li>
</ol>2. EV의 특성화
순화 EVs는 전송 전자 현미경 (TEM)23에 의해 구상 될 수 있다.
<ol><li>인산 염 버퍼에서 4 %paraformaldehyde 동등한 양으로 혼합 EV preps.</li>
	<li>코트 200 EV 정지 실 온에서 20 분의 5 µ L로 니켈 가장 격자 Formvar 카본 코팅 메쉬.</li>
	<li>0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.0), uranyl oxalate (pH 7.0) 대비 1%도 함께 가장 격자에 EV 샘플 흥분 하 고 4 %uranyl 아세테이트 및 2% 메 틸 셀 룰 로스 얼음에 1:9 비율에서의 혼합물에 포함.</li>
	<li>스테인레스 스틸 루프와 격자를 제거 하 고 필터 종이 메 틸 셀 룰 로스 필름의 적절 한 두께 보장 하기 위해 초과 하는 액체를 되 리.</li>
	<li>건조 후, 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 하 고 해당 이미지를 소프트웨어를 결합 하 여 디지털 카메라 캡처 이미지.</li>
</ol>3. 종양에서 파생 된 EVs에 의해 MSCs의 교육.
<ol><li>4 %EV 고갈 인간 혈소판 Lysate (hPL)24, 헤 파 린 (10 U/mL)와 1 알파-최소 필수 매체 (알파-MEM)을 보완 하 여 MSC 문화 매체를 준비 P/S/G. x 참고: EV 고갈 hPL 1.1 섹션에 설명 된 절차에 따라 얻을 수 있다.</li>
	<li>시드 1.4 x 106 75 cm2 플라스 크 당 MSCs 지방이 많은 파생 하 고 37 ° C에서 5 %CO2 인큐베이터에서 EV 고갈 MSC 문화 매체에 문화.</li>
	<li>때 셀 70% 합류에 도달, 추가 143B 다리-또는 인간의 섬유 아 세포 (hf) 제어-EVs, 10 µ L EV 준비/cm2 문화 플라스 크의. 24 시간 동안 incubate 고 추가 6 시간에 대 한 EVs의 동일한 금액을 추가 합니다. 참고: 인간의 섬유 아 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 교양 10 %FBS EVs 섹션 1에서에서 설명한 대로 격리 됩니다.</li>
	<li>MSC 상쾌한 수집, 1 x 4 ° C (최대 가속 및 감속 속도 설정)에서 5 분 동안 500 x g에서 원심, 새로운 튜브에 전송 및 저장 미래의 cytokine 분석 (섹션 5)을-80 ° C에서 지운된 상쾌한.</li>
	<li>비보에 대 한 실험 (단원 6), 섹션 3.1을 3.3에에서 설명 된 대로 GFP-긍정적인 MSCs25 교육, 수집 셀 하 고 주입까지 얼음에 100 µ L. 계속 셀 당 106 셀의 최종 농도에 PBS에 그들을 resuspend.</li>
</ol>4. EV 국제화의 시험
MSCs에서 EV 글귀를 시각화 하려면 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 링커 염료 (GFLD) (상용)와 EVs 레이블:
<ol><li>간단히, 200 µ L EV 준비에 희석제의 180 µ L를 추가 합니다. 희석제의 50 µ L에서 GFLD 염료의 1 µ L를 희석 하 고 추가 20 µ L 희석된 염료의 희석된 EV 준비.</li>
	<li>부드럽게 pipetting으로 혼합 하 고 어둠 속에서 실 온에서 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS에서 0.1 %BSA 5 mL을 추가 하 고 울트라-원심 분리기 관에 전송 PBS (최종 볼륨 38.5 mL/튜브) 튜브를 채울.</li>
	<li>원심 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 1 x (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 200 µ L의 최종 볼륨에서 레이블이 EV-펠 릿 resuspend (PBS 가진 볼륨 조절).</li>
	<li>MSC 문화를 레이블이 EVs를 추가 하거나-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 야간 보육, 후 형광 현미경 검사 법에 의해 소포 국제화를 평가 하 고 flow cytometry7.</li>
</ol>5입니다. MSC Cytokine 식 프로필의 평가입니다.
<ol><li>인터 루 킨-8 (IL-8)의 다중 정량화, 인터 루 킨-1β (IL 1β), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 인터 루 킨-10 (IL-10), 종양 괴 사 인자 (TNF) 및 MSC에서 인터 루 킨-12 p 70 (IL-12 p 70) 단백질 수준 조절 매체 (단계 3.4 참조) 사용 하는 상업적으로 사용할 수 있는 cytometric 구슬 배열 (CBA) 제조업체의 지침에 따라 인간의 염증 성 cytokines에 대 한.</li>
	<li>간단히, 항 체 활용 된 캡처 구슬 혼합을 모든 분석 결과 튜브를 추가 합니다. Cytokine 표준 희석 또는 조건된 중간 샘플 튜브를 추가 합니다.</li>
	<li>검출 시 약을 추가 하 고 실시간에 3 시간을 품 어</li>
	<li>워시 제공 된 세척 솔루션 비즈. 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 측정 하 고 제조업체의 지침에 따라 데이터를 분석.</li>
</ol>6. 다리의이 종이 식 Orthotopic 마우스 모델의 세대.
<ol><li>6 주 오래 된, 여성, Athymic 누드-Foxn1nu 쥐 실험 절차를 시작 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 순응을 허용 합니다.</li>
	<li>1 일 peri 요원으로 수술 전과 진통 식용 수에 해 열을 추가 합니다. "아이 들을 위한 해 열 솔루션" 희석 ( 재료의 표참조) 2 mg/mL의 최종 농도를 물으로. 150 mL/kg의 평균 물 섭취 량에 따라/일, 20 g의 평균 몸 무게,이 복용량은 6 밀리 그램의 복용량에 도달 / 마우스 충분 한 일 (300 m g/k g/일).</li>
	<li>수술 후, 또는 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 더 이상 24 시간까지 진통 치료를 계속 합니다.</li>
	<li>수술 당일 10 분에 대 한 300 x g에서 centrifuging 여 교양된 luciferase 양성 (Fluc) 143B 셀 (이전 lentiviral 변환에 의해 생성 된)를 수집 하 고 PBS에서 2 x 105 셀 / µ L의 농도에서 세포를 resuspend. 6 시간 얼음에 세포 현 탁 액을 유지.</li>
	<li>압력솥 수술 장비입니다. 준비 및 작업 영역을 청소 하 고 소독된가 위 핀셋 살 균 시트에 배치. 20 분 전에 수술 (6.8), 단계 주입 동물 피하 buprenorphine (0.05 mg/kg, 0.9% 식 염 수에 희석) 0.5 mL 인슐린 주사기 (29 게이지 바늘)을 사용 하 여 진통제로.</li>
	<li>각 동물을 마비 직전 채워 10 µ L 주사기 집중된 (Fluc) 143B 셀 서 스 펜 션의 1 µ L (단계 6.4 참조).</li>
	<li>Isoflurane 흡입 마 취 (산소에 2-3%)와 함께 동물 anesthetize 발가락 꼬 집는 동물에 의해 마 취의 수준을 확인 합니다. 동물을 곤란 하 게, 즉, 그것은 깊은 마 취에 반응 하지 않는 연 고 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용.</li>
	<li>동물 마 취 마스크에 머리와 운영자 쪽으로 다리의 뒷면에 위치. 왼쪽된 무릎을 플렉스. 70% 에탄올으로 피부를 닦 고 3 번 로컬 진통제로 목화 팁 lidocaine (2%)을 적용.</li>
	<li>무 균 수술 칼을 사용 하 여 노출 경골을 무릎 바로 아래 피부에 작은 절 개 (약 5 m m)를 확인. 약 2 m m 0.8 m m 마이크로 트위스트 드릴을 사용 하 여 무릎 아래 경골에 작은 구멍을 드릴 합니다. 두 경골 외피가 드릴스루할 수 없습니다 주의 해야 합니다.</li>
	<li>26-게이지 바늘을 사용 하 여 구멍에 천천히 (약 5 초)에서 1 µ L 세포 현 탁 액 (약 2 × 105 셀)를 주사. 현 탁 액의 역류를 방지 하기 위해 조직 접착제의 작은 물방울으로 구멍을 닫습니다.</li>
	<li>Monofilament 봉합 및 조직 접착제 한 방울 피부를 닫습니다. 잘가 열된 환경 (열 램프 사용)에서 동물 복구 하자. 두지 마십시오 동물 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지. 동물 마 취에서 완전히 복구는, 후에 그들의 자신의 감 금 소에 그들을 반환 합니다.</li>
	<li>종양 접종 후 2 일 교육 EV 또는 순진한 GFP-긍정적인 MSCs를 주입 (100 µ L PBS에 106 세포 단계 3.5 참조) 쥐의 꼬리 정 맥에 0.5 mL 인슐린 주사기와 정 맥.</li>
	<li>생물 발광 영상26 일주일에 두 번 여 종양의 성장에 따라. 이 위해, 150 µ L 마우스 i.p. 주입 D-인슐린 주사기 (30 mg/mL)를 소. 주입 후 10 분 이미징 시스템 생물 발광에 동물을 종양 세포에 의해 생성 된 광자 유량을 측정.</li>
	<li>또한, 캘리퍼스 기본 뼈 종양의 직경을 측정 합니다. (M m3)에 종양 볼륨 x 0.5 x 길이2 폭으로 추정 된다.</li>
	<li>참고: 인간적 끝점 종양 직경으로 정의 된다 > 15 m m 또는 체중 감소 > 15%.</li>
</ol>7입니다. 폐 결 절 수의 평가
<ol><li>동물 중 하나에 정의 된 단계 6.14 (약 3-4 주) 인간적 끝점에 도달 하면, 실험을 종료 하 고 수집 하 고 분석 하는 모든 관련 조직.</li>
	<li>Euthanization, 전에 10 분 주사 150 µ L D-소 (30 mg/mL) 0.5 mL 인슐린 주사기.</li>
	<li>Anesthetize isoflurane 흡입 마 취와 함께 동물 (단계 6.7 참조). 발가락을 꼬 집는 마우스의 반응의 부재에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위27여 쥐를 안락사.</li>
	<li>폐, 간, 비장, 신장 소독된가 위 핀셋을 사용 하 여 수집 합니다. 혈액 자취를 제거 하 고 배양 접시에 그들을 넣어 PBS에 장기를 씻어.</li>
	<li>이미징 시스템 생물 발광에 장기와 배양 접시를 놓습니다. 장기의 양쪽에 생물 발광 신호를 측정 합니다. 측정, 직후 미래 조직학 분석을 위해 그들에 게 (24-72 시간, RT) 흥분을 4% 포 르 말린에 장기 급락.</li>
	<li>수동 임계 처리 하 여 적절 한 이미징 소프트웨어 얻은 그림을 처리 합니다. 각 사진에 폐 작은 혹의 수를 계산 합니다. 양쪽 폐에 폐 작은 혹의 총 수를 계산 합니다.</li>
</ol>8. 조직학 분석
<ol><li>폐 조직의 조직학 분석:<ol>
<li>파라핀에 포 르 말린 고정 장기를 포함 하 고 6 µ m 조직 슬라이드를 준비.</li>
		<li>Deparaffinate 폐 조직 슬라이드 하 고 0.01 M 구 연산 염 버퍼 (pH 6)에서 15 분 동안 그들을 비등 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.</li>
		<li>반대로 인간의 vimentin 항 체 (200 µ g/mL) 희석 1:150 항 체 희석 액 (상용)에 그 후 보조, HRP 표시 된 항 체 (0.5 mg/mL, 희석 1: 500) 실 온에서 가로로 슬라이드를 품 어. 조직 diaminobenzidine (DAB)-3'와 hematoxylin 카운터 얼룩 얼룩.</li>
		<li>해당 카메라 및 이미지 소프트웨어를 결합 하는 광학 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 슬라이드를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 tibias에 GFP-긍정적인 MSCs의 존재를 평가:<ol>
<li>Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.24 M, pH 7.2-7.4 tibias 알려줍니다 뼈 유연 하 게 (약 1 주일)까지 매일 EDTA 버퍼를 새로 고칩니다.</li>
		<li>Tibias 탈수 하 고 파라핀을 침투. 파라핀 블록에 tibias (osteosarcoma 조직 포함)를 포함 합니다.</li>
		<li>6 µ m 파라핀 섹션을 준비 하는 톰을 사용 합니다. 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 놓습니다. 건조 후, 실 온에서 하룻밤 슬라이드를 저장 합니다.</li>
		<li>구 연산 염 버퍼를 사용 하 여 열 중재 항 원 검색 수행 (8.1.2 참조)와 1:900 항 체 희석 액에 희석에 안티-GFP 항 체 (전체 원으로)로 조직 얼룩. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 조직 counterstain</li>
		<li>조직 슬라이드 해당 이미징 소프트웨어를 결합 하는 형광 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Karnoub, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis.">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+mesenchymal+stem+cells+into+prostate+tumours+promotes+metastasis.">Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis.</a> Nat Commun. 4, 1795 (2013).</li><li>Shahar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percentage+of+mesenchymal+stem+cells+in+high-grade+glioma+tumor+samples+correlates+with+patient+survival.">Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival.</a> Neuro Oncol. 19 (5), (2016).</li><li>Behnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+brain+tumor-derived+mesenchymal+stem+cells+contribute+to+brain+tumor+progression.">Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression.</a> Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).</li><li>Giallongo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-like+myeloid+derived+suppressor+cells+(G-MDSC)+are+increased+in+multiple+myeloma+and+are+driven+by+dysfunctional+mesenchymal+stem+cells+(MSC).">Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC).</a> Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).</li><li>Baglio, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+tumor-educated+MSC+paracrine+activity+halts+osteosarcoma+progression.">Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression.</a> Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-associated+mesenchymal+stem/stromal+cells:+emerging+therapeutic+targets.">Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).</li><li>Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+key+players+in+cancer+progression.">Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression.</a> Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltrating+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+increase+prostate+cancer+stem+cell+population+and+metastatic+ability+via+secreting+cytokines+to+suppress+androgen+receptor+signaling.">Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling.</a> Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).</li><li>Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+promote+growth+and+angiogenesis+of+tumors+in+mice.">Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice.</a> Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).</li><li>Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+protect+breast+cancer+cells+through+regulatory+T+cells:+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+TGF-beta.">Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta.</a> J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).</li><li>Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+cancer:+Cell-to-cell+mediators+of+metastasis.">Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis.</a> Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+protein+that+promote+tumor+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li><li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+extracellular+vesicle-mediated+phenocopying+of+metastatic+behavior.">In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior.</a> Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).</li><li>Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+exosomes+trigger+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation.">Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation.</a> Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).</li><li>Webber, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+tumour-promoting+stromal+myofibroblasts+by+cancer+exosomes.">Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes.</a> Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li><li>Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).</li><li>Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+viral+microRNA+exchange+via+exosomes+in+vitro+and+in+vivo.">Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo.</a> Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).</li><li>Baglio, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow-+and+adipose-mesenchymal+stem+cells+secrete+exosomes+enriched+in+distinctive+miRNA+and+tRNA+species.">Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species.</a> Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).</li><li>Naaijkens, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+fetal+bovine+serum+substitute+improves+human+adipose-derived+stromal+cell+culture+for+future+cardiac+repair+applications.">Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications.</a> Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).</li><li>Grisendi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+as+stable+source+of+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+delivery+for+cancer+therapy.">Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy.</a> Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).</li><li>Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Saut&#232;s-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-based+tumor+quantification+method+for+monitoring+tumor+progression+and+treatment+effects+in+mouse+lymphoma+models.">Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Carbone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cervical+dislocation+as+a+humane+euthanasia+method+in+mice.">Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor-derived+exosomes+selectively+impair+lymphocyte+responses+to+interleukin-2.">Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2.</a> Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).</li><li>Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+promote+regulatory+t+cell+expansion+and+induce+apoptosis+in+tumor-reactive+activated+cd8++T+lymphocytes.">Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes.</a> J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).</li><li>Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-released+microvesicles+as+vehicles+of+immunosuppression.">Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression.</a> Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Lin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+exosomes+endow+mesenchymal+stromal+cells+with+tumour-promotion+capabilities.">Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities.</a> Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

종양-분 비 세포 외 소포 (EVs) 종양 지원 환경 생성 하 현지와 먼 중간 엽 세포의 생리학을 변경할 수 있습니다. 여기 우리가 종양 세포 간의 EV 중재 한 상호 작용의 해 부를 수 있는 다리의 전 임상 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) vivo에서. 우리는 인간의 종양 마우스 다리 xenografts 강하게 베어링의 EV 교육 MSCs의 조직의 주입7일-6/STAT3 신호 통로 활성...

종양 microenvironment tumorigenesis 및 암 진행, 전이 형성 등의 치료제1저항 개발의 대부분, 그렇지 않으면 모두, 측면에서 적극적으로 참여 합니다. 이 종양 틈새에서 발생 하는 복잡 한 종양-기질 상호 작용의 해 부를 수 있는 전 임상 orthotopic 암 마우스 모델에 대 한 필요성을 강조 하고있다.
종양 microenvironment의 많은 세포 구성 성분 중에서 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 강하게 유방암, 전립선 암, 뇌종양, 다 발성 골 수 종, 및 다리2 등 여러 암 종류의 암 진행에 기여 ,3,,45,,67. MSCs는8,9골 수, 지방 조직, 태 반, 탯 줄 혈액, 등을 포함 하 여 다양 한 성인 그리고 태아 조직에 있는 multipotent 줄기 세포 이다. 염증 신호 암 생성에 대 한 응답, MSCs 종양 사이트 쪽으로 마이그레이션할 종양 microenvironment에 통합 고 궁극적으로 암 지원 셀10으로 차별화 합니다. 이러한 암 관련 된 MSCs 종양 진행 행동 종양 세포에 및 주변 기질2, 에 대 한 필수적인 요인 (즉, 성장 요인, 발산, cytokines, 면역 중재자) 제공 3 , 11 , 12 , 13. 동안 종양 증진 효과 암 관련 된 MSCs의 수많은 암 모델에서 조사 되어, 종양 세포는 암 홍보 틈새를 형성 하는 MSCs 재 설 정할 메커니즘 제대로 이해 하는. 여기는 orthotopic이 종이 식 모델을 구체적으로 extracellular 소포 (EVs) 통해 뼈 암 세포와 MSCs의 프로 tumorigenic 상호작용 연구의 생성에 설명 합니다.
EVs는 종양과 stromal 세포14사이 세포 커뮤니케이션의 중요 한 중개자. EVs의 원산지, 단백질, 지질, 및 규제 RNAs를 포함 하 여 세포의 기능 생체 나. 일단 세포 외 공간에서 발표,이 소포 주변 세포에 의해 채택 될 수 있다 또는 혈액 이나 림프 순환 통해 먼 사이트에 고 뿌리깊은 대상 셀 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 15 , 16 , 17 예를 들어, stromal 섬유 아 세포에 의해 암 EVs의 신생을 지원 하 고 종양 성장 을 vivo에서18,19, 내 피에 의해 국제화 가속 myofibroblast 차별화에 발생할 수 있습니다. 셀 수 있는 종양 혈관 신생을 자극 하 고 증가 혈관 침투성16,20, 그리고 면역 세포와의 상호 작용21antitumor 면역 반응 억제로 이어질 수도 있습니다.
우리는 최근 시연, 종양 세포 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형 얻으려고 MSCs 프롬프트 EVs의 높은 금액을 출시, 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델을 사용 하 여. 이 효과 MSC cytokine 식 프로 파일 ("MSC 교육" 라고도 함)에 있는 극적인 변화 때문 이며 치료 인터 루 킨-6 수용 체 (IL-6R) 항 체7의 행정에 의해 방지 될 수 있다. 우리의 일 암 EVs 다리 진행 중단 microenvironment 대상 접근에 대 한 근거를 제공 하는 MSC 행동의 중요 한 변조기는 설명 했다. 여기, 우리는 EV 중재 종양-MSC 상호 작용에서 vivo에서조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델을 것입니다: 1) 특히 종양 microenvironment 암 EV 유도 변경 MSC 행동의 정의 2) 어떻게이 상호 작용에 기여 뼈 종양 성장 및 전이 형성, 그리고 연구 3) 방해 하는 여부를 평가 vivo에서 EV 중재 누화 암 진행을 방지합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor</td></tr><tr><td>Transmission electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>Or similar TEM</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td><td>Or similar camera</td></tr><tr><td>Imaging software TEM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>Or similar Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Imaging software FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R</td><td></td></tr><tr><td>-80 Freezer</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>Or similar flow cytometer</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>With 0.8 mm drill</td></tr><tr><td>HSS micro twist drills, 0.8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0.8 mm drill</td></tr><tr><td>IVIS camera</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living image software2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen is now part of Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L Syringe</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Model 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Heat Lamp</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>Platelet Lysate</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>IMDM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>pen/strep/glutamine</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adipose deriverd MSCs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>GFP-positive MSCs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>human fibroblasts</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>143B cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>FLUC-143B cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>Transduced</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Disposables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Freeze tubes</td><td>Thermoscientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes</td></tr><tr><td>0,22 &amp;micro;m filter</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL insulin syringes with 29G Needle</td><td>Terumo</td><td>U-100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper&amp;nbsp;</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents / kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Braun</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>uranyl oxalate</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>urany acetate</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>methyl cellulose</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>Referred to in the manuscript as GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - human inflammatory cytokine kit</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel surgical blades</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>Referred to in the manuscript as surgical knife</td></tr><tr><td>anti-human vimentin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Clone V9</td></tr><tr><td>Antibody diluent</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP-labeled anti mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>hematoxyllin</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buffer</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Citrate buffer</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rabbit polyclonal anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>n.a.</td><td>Ab290</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup</td><td>Bayer</td><td>n.a.</td><td>Sinaspril, paracetamol solution for kids</td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Vumc pharmacy</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine-HCL 2%</td><td>Vumc pharmacy</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue</td><td>Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel loops&amp;nbsp;</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice experiments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&amp;nbsp; female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Paper-pulp smart home (cage enrichment)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-dri bedding material</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>(or similar)</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>(or similar)</td></tr></tbody></table>

a preclinical mouse model of osteosarcoma to define the extracellular vesicle-mediated communication between tumor and mesenchymal stem cells

종양 microenvironment 내 거주 또는 모집 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 여러 암 종류에 악성 진행에 기여 한다. 특정 환경 신호 영향이 성인 줄기 세포 paracrine 중재자 가속된 종양 성장 및 전이 해제할 수 있습니다. 종양 및 MSCs 사이 누화를 정의 암 진행을 기본 메커니즘을 이해 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 목표를 식별 하려면 기본 중요성 이다.
암 세포 생성 높은 양의 extracellular 소포 (EVs), 뿌리깊은 대상 세포 종양 microenvironment에 또는 먼 사이트에서의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 EVs 염증 성 RNAs 등 (onco) 단백질, 암 세포의 전이 행동을 강화 하거나 미리 전이성 틈새 시장 형성에 참여 stromal 세포 교육 수 기능 생체를 묶습니다. 이 문서에서는, 우리는 EV 중재 누화 종양 사이의 중간 엽 줄기 세포의 특정 평가 가능 하 게 하는 전 임상 암 마우스 모델의 개발을 설명 합니다. 첫째, 우리는 정화 및 종양 분 비 EVs의 특성화 및 MSCs에서 EV 국제화 평가 설명합니다. 우리 다음 게 암 EVs에 의해 유도 된 다중 구슬 기반 immunoassay MSC cytokine 식 프로필 변경을 평가 하의 사용. 마지막으로, 우리이 종양-msc와 상호 작용 하는 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 기여를 표시.
우리의 모델 암 EVs 종양 지원 환경 형성 하는 방법을 정의 하 고 종양 및 MSCs 간의 EV 중재 통신의 봉쇄 암 진행을 방지 하는 여부를 평가 기회를 제공 한다.

이 연구에서 우리는 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형으로 MSCs 교육 다리 분 비 EVs 수 탐험. 우리 다리 셀 MSCs에 의해 내 면화는 exosome 같은 EVs 릴리스 보여줍니다. 우리 암 EVs에 의해 유도 된 MSC cytokine 식 프로필의 변경을 측정 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 효과 평가. 연구 디자인의 일반적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
<p class="j...

Watch this Scientific Journal Video about A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.1K 조회수.  VU Medical Center. 골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

연구

암 연구학

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common mutations associated with RMS and allowed discrimination of different RMS subtypes, major challenges still exist for the development of novel treatments to further improve prognosis. Although identified by the expression of myogenic markers, there is still significant controversy over whether RMS has myogenic or non-myogenic origins, as the cell of origin is still poorly understood. In the present study, a reliable method is provided for the tumorsphere assay for mouse RMS. The assay is based on functional properties of tumor cells and allows the identification of rare populations in the tumor with tumorigenic functions. Also described are procedures for testing recombinant proteins, integrating transfection protocols with the tumorsphere assay, and evaluating candidate genes involved in tumor development and growth. Described further is a procedure for allograft transplantation of tumorspheres into recipient mice to validate tumorigenic function in vivo. Overall, the described method allows reliable identification and testing of rare RMS tumorigenic populations that can be applied to RMS arising in different contexts. Finally, the protocol can be utilized as a platform for drug screening and future development of therapeutics.

This protocol describes a reproducible method for isolation of mouse rhabdomyosarcoma primary cells, tumorsphere formation and treatment, and allograft transplantation starting from tumorspheres cultures.

마우스 횡문근에서 분리 된 원발성 종양 세포에서 종양 구체 유도 및 치료

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

유전학

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of DNA samples. It is resourceful, requires small amounts of DNA, and takes around 4&#8211;5 h of hands-on work. In the presented technique, DNA samples are first denatured then hybridized to probes that target DNA at either methylated or reference sites as a control. Hybridized DNA is separated into parallel reactions, one undergoing only ligation and the other undergoing ligation followed by HhaI-mediated digestion at unmethylated GCGC sequences. The resultant DNA fragments are amplified by PCR and separated by capillary electrophoresis. Methylated GCGC sites are not digested by HhaI and produce peak signals, while unmethylated GCGC sites are digested and no peak signals are generated. Comparing the control-normalized peaks of digested and undigested versions of each sample provides the methylation dosage ratio of a DNA sample. Here, MSPA is used to detect the effects of osteosarcoma-derived extracellular vesicles (EVs) on the methylation status of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) in mesenchymal stem cells. LINE-1s are repetitive DNA elements that typically undergo hypomethylation in cancer and, in this capacity, may serve as a biomarker. Ultracentrifugation is also used as a cost-effective method to separate extracellular vesicles from biological fluids (i.e., when preparing EV-depleted fetal bovine serum [FBS] and isolating EVs from osteosarcoma conditioned media [differential centrifugation]). For methylation analysis, custom LINE-1 probes are designed to target three methylation sites in the LINE-1 promoter sequence and seven control sites. This protocol demonstrates the use of MSPA for LINE-1 methylation analysis and describes the preparation of EV-depleted FBS by ultracentrifugation.

Described here is the use of a methylation-specific probe amplification method to analyze methylation levels of LINE-1 elements in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Ultracentrifugation, a popular procedure for separating extracellular vesicles from fetal bovine serum, is also demonstrated.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival rate of osteosarcoma patients with pulmonary metastasis is less than 30%.Therefore, the utilization of mouse models mimicking the osteosarcoma development in humans is of great significance for understanding the fundamental mechanism of osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis to develop novel therapeutics. Here, detailed procedures are reported to generate the primary osteosarcoma and pulmonary metastasis mouse models via&#160;intratibia injection of osteosarcoma cells. Combined with the bioluminescence or X-ray live imaging system, these living mouse models are utilized to monitor and quantify osteosarcoma growth and metastasis. To establish this model, a basement membrane matrix containing osteosarcoma cells was loaded in a micro-volume syringe and injected into one tibia of each athymic mouse after being anesthetized. The mice were sacrificed when the primary osteosarcoma reached the size limitation in the IACUC-approved protocol. The legs bearing osteosarcoma and the lungs with metastasis lesions were separated. These models are characterized by a short incubation period, rapid growth, severe lesions, and sensitivity in monitoring the development of primary and pulmonary metastatic lesions. Therefore, these are ideal models for exploring the functions and mechanisms of specific factors in osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis, the tumor microenvironment, and evaluating the therapeutic efficacy in vivo.

The present protocol describes intratibia osteosarcoma cell injection to generate mouse models bearing orthotopic osteosarcoma and pulmonary metastasis lesions.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of pluripotent stem cells, are favored for their instant availability and proven safety. It has been reported that transplantation of BM-MSCs is of great benefit to repairing injured tissues in various diseases, which might be related to modulating the immune and inflammatory responses via paracrine mechanisms. Extracellular vesicles (EVs), featuring a double-layer lipid membrane structure, are considered to be the main mediators of the paracrine effects of stem cells. Recognized for their crucial roles in cell communication and epigenetic regulation, EVs have already been applied in vivo for immunotherapy. However, similar to its maternal cells, most of the studies on the efficacy of transplantation of EVs still remain at the level of small animals, which is not enough to provide essential evidence for clinical translation. Here, we use density-gradient centrifugation to isolate bone marrow cells (BMC) from porcine bone marrow at first, and get porcine BM-MSCs (pBM-MSCs) by cell culture subsequently, identified by the results of observation under the microscope, induced differentiation assay, and flow cytometry. Furthermore, we isolate EVs derived from pBM-MSCs in cell supernatant by ultracentrifugation, proved by the techniques of transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting successfully. Overall, pBM-MSCs and their derived EVs can be isolated and identified effectively by the following protocols, which might be widely used in pre-clinical studies on the transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

This article elaborates a method to isolate and identify porcine bone marrow mesenchymal stem cells (pBM-MSCs) and extracellular vesicles (EVs) derived from them, providing a methodological basis for the pre-clinical evaluation of transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of ...

의학

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...