세포의 초세구조와 관련하여 단백질의 국소화는 수십 년 동안 강력한 연구 도구였습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 풍부도가 낮거나 찾기 어려운 단백질을 확장했습니다. 형광 현미경을 사용하여 민감하고 스크리닝 가능한 방식으로 단백질을 라벨링하고 전자 현미경과 결합하여 세포의 미세 구조를 다시 채웁니다.
여기서 우리는 자가포식 단백질에 대한 절편 CLEM을 시연할 것이지만, 세포의 초구조가 특히 희귀한 사건에 대한 연구에서 관심이 있는 모든 생물학적 질문에 실제로 적용될 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 선임 연구 기술자인 Tineke Veenendaal입니다. 시작하려면 섭씨 37도로 예열된 PBS에서 0.15% 글리신이 포함된 PBS를 1% 젤라틴으로 교체합니다.
젤라틴의 세포를 긁어내어 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심 분리기에 있는 실내 온도에 6, 000 G에 세포를 펠릿은 펠릿을 교란하기 없이 그 후에 젤라틴을 제거한다. 섭씨 37도로 예열된 12%의 젤라틴을 펠릿에 넣고 동일한 온도로 예열된 피펫 팁 또는 유리 목초지 피펫으로 피펫팅하여 부드럽게 재현탁합니다.
섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 다음 6, 000 G에서 세포를 1분 동안 펠렛으로 만듭니다. 젤라틴을 얼음 위에서 30분 동안 굳힙니다. 튜브에서 젤라틴이 박힌 세포를 제거하려면 면도날로 튜브의 나머지 부분에서 펠릿이 들어 있는 튜브 끝을 잘라냅니다.
그런 다음 셀 펠릿이 있는 튜브 끝을 첫 번째 절단에 수직으로 반으로 자릅니다. 세포 펠릿을 포함하는 두 개의 튜브 끝 반쪽을 2.3몰 자당에 넣고 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 이로 인해 세포 펠릿 반쪽이 약간 줄어들고 플라스틱 튜브에서 떨어집니다.
자당에서 젤라틴이 박힌 세포 펠릿이 있는 튜브 반쪽을 제거한 다음 핀셋으로 플라스틱 튜브 반쪽에서 세포 펠릿 반쪽을 제거합니다. 면도날로 펠릿을 적절한 크기의 블록으로 수동으로 자르고 절단하는 동안 실체 해부 현미경을 사용하여 피사체를 확대합니다. 섭씨 4도에서 2.3몰 자당에서 밤새 세포 블록을 배양합니다.
알루미늄 샘플 홀더 핀에 놓습니다. 블록과 핀 사이에 얇은 고리를 형성하도록 블록의 가장자리 주위에 충분한 자당을 남겨 둡니다. 스냅 얼려서 액체 질소에 보관하십시오.
블록의 전면을 잘라 표면을 평평하게 하여 약 250나노미터 두께의 섹션을 얻습니다. 그런 다음 칼 모서리로 샘플 블록 표면의 측면에 50-100 마이크로미터를 분할하여 블록의 측면을 자릅니다. 샘플 블록 면의 4면을 트리밍하면 약 250 x 375마이크로미터 직사각형이 돌출됩니다.
단면은 돌출된 직사각형에서 리본을 단면화하여 단면의 두께가 70-90나노미터 사이이고 은빛 황금빛 광택을 갖도록 합니다. 긴 리본을 만들기 위해 막대기에 머리카락으로 다이아몬드 나이프의 가장자리에서 섹션을 멀리 안내합니다. 3mm 픽업 루프를 2.3몰 자당과 2% 메틸셀룰로오스의 일대일 혼합물에 담가 리본을 집어 올립니다.
마이크로톰의 극저온 챔버에 루프를 삽입하고 액적이 얼기 시작하면 액적을 부드럽게 눌러 섹션을 즉시 집어 올립니다. 극저온 챔버에서 루프를 제거합니다. 물방울이 완전히 해동될 때까지 기다렸다가 준비된 그리드에 물방울을 누릅니다.
작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트에 약 1ml의 PBS에 섹션이 있는 그리드를 놓고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. Parafilm에서 약 75 마이크로 리터의 액적에서 그리드를 처리하고 실온에서 PBS 글리신 세척으로 시작합니다. PBS에 0.1%의 소 혈청 알부민 C와 0.5%의 생선 껍질 젤라틴으로 만든 차단 완충액으로 그리드를 차단 단계로 실온에서 10분 동안 배양합니다.
PBS의 차단 완충액에 1차 항체를 희석하고 이 용액의 약 10마이크로리터 방울에 그리드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS의 0.1% 소 혈청 알부민으로 그리드를 실온에서 5회 세척합니다. PBS의 차단 완충액에 2차 항체와 DAPI를 희석합니다.
그런 다음 이 용액의 약 10마이크로리터 방울에 그리드를 실온에서 30분 이상 배양한 후 앞서 표시한 대로 PBS에서 그리드를 5회 세척합니다. 광학 현미경 검사용 샘플을 장착하려면 그리드를 증류수에 50% 글리세롤에 두 번 담그고 실온에서 5분 동안 담그십시오. 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 커버 슬립당 하나의 그리드를 50% 글리세롤로 배치하여 섹션이 커버 슬립을 향하도록 합니다.
광학 현미경 검사의 경우, 끼워진 격자가 있는 유리 슬라이드를 자동 스테이지가 있는 광시야 현미경으로 가져갑니다. 고배율 오일 대물렌즈를 선택하고 단면 리본의 이미지 타일 세트를 생성합니다. 다음으로, 탈착 및 전자 현미경 또는 EM 대조를 위해 유리 슬라이드 커버 슬립 샌드위치 측면에 10마이크로리터의 증류수를 추가하고 모세관 작용이 유리 커버 슬립 샌드위치 인터페이스를 채울 때까지 기다립니다.
글리세롤에 침지 오일을 섞지 않고 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 핀셋으로 그리드를 회수하고 실온에서 증류수에 세 번 담가 50% 글리세롤을 씻어냅니다. 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼로 그리드 뒷면을 조심스럽게 말리고 그리드 섹션이 아래로 향하도록 증류된 물방울 위에 놓습니다.
전자 현미경에서 대비를 위해 절편을 염색하려면 실온에서 5분 동안 우라닐 아세테이트로 배양합니다. 우라닐 아세테이트 메틸셀룰로오스 용액을 얼음 위의 금속판에 Parafilm의 물방울을 놓아 냉각시킵니다. 그런 다음 이 얼음처럼 차가운 용액으로 그리드를 두 번 씻고 용액에서 10분 동안 배양합니다.
각 격자 아래의 우라닐 아세테이트 메틸셀룰로오스 방울에 격자 건조 루프를 삽입하고 격자가 물방울에서 당겨질 때까지 부드럽게 들어 올려 격자를 고리로 만듭니다. 여분의 용액을 닦아내려면 보풀이 없는 여과지에 약 60도 각도로 고리를 대고 용액이 더 이상 흡수되지 않을 때까지 용지를 따라 천천히 끕니다. 그리드가 있는 루프를 적절한 랙에 놓고 실온에서 10분 이상 건조시킵니다.
광학 현미경으로 얻은 개요를 사용하여 투과 전자 현미경 또는 TEM에서 이미징을 위한 관심 영역을 찾고 광학 현미경 데이터 세트에서 ROI에 주석을 달 수 있습니다. 일단 지구가 선정되면, 20, 000x에서 50 의 000x 확대에 놓인 이미지 도와를 TEM에 있는 얻는다. 후처리 소프트웨어에서 이미지 타일 세트를 재구성합니다.
전자 현미경에서 DAPI 신호와 형광 및 핵 윤곽을 기반으로 상관 관계를 수행합니다. 이미지를 이동하여 정확하게 오버레이하고 수동 상관 관계를 정확하게 수행합니다. 간모세포종 유래 HEPG2 세포를 EBSS에서 2시간 동안 굶주린 후 4% 파알데히드로 2시간 동안 고정시켰다.
절편에서 LC3 및 LAMP1의 IF 이미징은 상대적으로 적은 LC3 반점과 LAMP1과의 공동 국소화가 거의 없음을 보여줍니다. IF의 분자 정보는 DAPI와 핵 윤곽을 기반으로 하는 두 가지 이미징 방식을 오버레이하여 전자 현미경에서 얻은 초구조 정보와 연결되었습니다. LC3 양성 소기관과 EM 초미세 구조의 상관 관계는 서로 다른 반점이 자가포식의 뚜렷한 단계를 나타낸다는 것을 보여주었습니다.
상자 1에 예시된 개별 LC3 라벨이 부착된 구획의 미세 구조가 여기에 나와 있습니다. 상관 광 전자 현미경 이미지는 왼쪽에 표시되고 유사 컬러 전자 현미경 이미지는 오른쪽에 표시됩니다. 내부 및 외부 자가포식체 막은 흰색과 검은색 화살촉으로 표시됩니다.
흥미롭게도, EM은 상대적으로 약한 형광 반점을 LC3 양성 자가리소체로 식별했는데, 이는 밀도가 높은 함량과 내강 내 소포가 특징입니다. 이는 초박형 극저온 절편의 IF에서 최소한의 LC3 가시성을 보여주며, 분해 환경에도 불구하고 정상 상태 autolysosome에서 검출 가능한 LC3를 시사합니다. 그러나 LC3 양성 반점은 주로 자가포식체를 나타내며 자가포식체를 나타내는 것은 거의 없습니다.
절편 CLEM 대신 immunogold 표지를 수행하고자 하는 연구자의 경우, 여기에 설명된 프로토콜과 팁은 immunogold 표지에도 완벽하게 적용할 수 있습니다. 우리는 처음에 저농도의 엔도솜 조절 단백질에 절편 CLEM을 적용했고 처음으로 내인성 초구조적 국소화를 보여주었습니다.
