Name: correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with β-amyloid plaques
Uploaded: 2016-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
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We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

참고 : 대학 라발의 동물 관리위원회에 의해 관리로 모든 실험 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 부합에서 기관 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 4 세 사이 21개월 APP-PS1 수컷 마우스를 사용 하였다. 음식과 물을 무료로 이용할와 25 °의 C -이 동물은 22에서 12 시간 명암주기에서 보관 하였다. 1. 메 톡시 - X04 솔루션 준비 <ol><li> 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 45 % 프로필렌 글리콜 및 45 % 인산 나트륨 완충 용액 (100 mM의 인산 완충액에서 0.9 % NaCl을 함유하는 용액에 메 톡시 X04 용해 톡시 - X04 (9)의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 , 산도 7.4). <ol><li> 마이크로 저울을 사용하여 메 톡시 X04 화합물 5 mg의 무게. 흄 후드에서 DMSO에 톡시 - X04 녹이고 투명한 녹색 용액이 얻어 질 때까지 교반한다. 이어서 프로필렌 글리콜 pH를 추가각 추가로 교반하면서 생리 식염수를 버퍼 osphate. </li><li> 회 전자의 O / N 4 ° C에서 솔루션을 저어. 황색 녹색 에멀젼을 얻습니다. 용액을 저하없이 두 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 메 톡시 - X04 솔루션 주입 <ol><li> 이전에 24 시간의 관류는 쥐의 무게와 27 ½ G 바늘을 이용하여 체중의 10 ㎎ / ㎏의 투여 량에서 각 마우스에게 메 톡시 X04의 복강 내 주사를 준다. </li></ol> 주입 된 쥐의 3 Transcardial 관류 <ol><li> 관류 하루전, 인산염 완충 식염수 (PBS), 3.5 %의 아크롤레인, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (13)의 적절한 양을 준비하고 4 ° CO / N에이를 저장한다. 참고 :이 솔루션은 관류 모두 면역 조직 화학 사전은-포함에 사용됩니다. 아크롤레인 작업 때 모두 부식성 및 독성이 같은 특수주의연구자 및 환경. 아크롤레인 플라스틱 부식성 때문에 또한 항상 아크롤레인 용액​​을 조제 적합한 유리를 사용한다. </li><li> 관류 날, 25 ㎛의 입자 보존 거친 여과지를 사용하여 PFA 및 아크롤레인 필터. </li><li> 재관류 동안 25 ㎖ / 분의 유속, PBS 15 ㎖, 아크롤레인 75 mL를 연속적으로 순환 마우스 PFA 150 ㎖을 제공하는 연동 펌프를 사용한다. 주의하십시오. PFA 아크롤레인의 유해 가스를 피하기 위해 흄 후드 안쪽 엄격 관류를 수행한다. <ol><li> 펌프를 설정 PBS 용액에 한쪽 끝을 삽입, PBS로 (약 15 ml의 유지) 튜브를 작성하고 다른 쪽 끝으로 25 G 날개 혈액 수집 바늘을 해결합니다. 항상, 튜브 어떤 갇힌 공기 방울이 없는지 확인합니다. </li><li> PBS로 채워진 튜브로 관류 펌프를 설정 한 후 아크롤레인 병에 직접 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li>복강 27 ½ G 바늘을 사용하여 주입 나트륨 펜 토바 비탈의 체중 량의 90 ㎎ / ㎏로 한 번에 하나의 마우스 aesthetize. 꼬리 / 발가락 핀치에 대한 응답을 평가합니다. 마우스는 혐오, 고통스러운 자극에 응답하지 않는 경우에만 진행합니다. </li><li> 작업 표면에 앞발과 hindpaws 테이핑으로 (위쪽면과 뒷면에 누워) 앙와위에서 마우스를 안전하고 조심스럽게 다른 장기에 손상을주지 않고 심장​​을 노출. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다. <ol><li> 흉곽에 꼬리를 시작 흉부 정중선을 따라 수술 용 가위로 피부를 통해 절개를 수행하고 쇄골에 주동이를 진행합니다. </li><li> 복부 흉곽의 기본을 따라 두 개의 추가 횡 절개를합니다. 조심스럽게 이동하고 전체 흉강을 노출해야하고, 피부의 두 날개를 핀. </li><li> 흉강을 노출 무딘 집게와 칼 모양의 과정을 잡고 날카로운 가위를 안정에스. 다이어프램과 흉곽을 통해 잘라 폐 천공되지 않도록주의하면서, 그리고 쇄골에 절개 주동이를 계속합니다. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 무딘 집게와 함께 심장 막 주머니를 찢어. , 무딘 집게로 꾸준한 마음을 잡고 우심방을 절감하고, PBS의 주입을 시작합니다. 즉시 좌심실로 혈액 수집 바늘을 삽입합니다. </li><li> 다음 (150 ml의에 해당) 6 분 동안 PFA로 전환 (75 ml의에 해당) 3 분 동안 아크롤레인 다음 PBS와 마우스를 (튜브)에 관류. 튜브에 들어 거품을 방지하기 위해 솔루션을 전환하기 전에 펌프 흐름을 일시 중지해야합니다. </li><li> 마우스를 목을 벨과 고정 뇌를 추출하고 4 ° C에서 적어도 2 시간 동안 4 % PFA를 포함하는 유리 병에 직접 배치합니다. <ol><li> 뇌를 추출하려면, 두개골을 노출 피부를 통해 절단 가위와 핀셋을 사용합니다. 조심스럽게 두개골 연산 휴식눈 사이에 엉, 그것의 작은 조각을 칩은 기본 뇌를 노출합니다. </li><li> 조심스럽게 vibratome 절편에 대한 진행하기 전에 추가로 2 시간 동안 4 % PFA로 노출 된 뇌 및 사후 수정을 제거합니다. </li></ol></li></ol> Vibratome를 사용하여 4. 뇌 단면 <ol><li> 냉장 PBS로 고정 된 뇌를 3 회 반복한다. 예리한 면도날을 사용하여 (이 영역은 조사가 아닌 경우) 후각 망울을 제거하고 (2)에 횡 뇌 컷 - 절차를 가속화하기 위해 동시에 절단 할 수 모두 거의 동일한 높이의 3 개. </li><li> 수직 트레이에 고정 된 표본 판에 뇌 조직의 조각을 접착제. 매끄러운 절단면이 시편 판에 단단히 스틱과 절편 과정에서 빠질되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 전체 뇌 표면이 완전히 침수 될 때까지 트레이에 충분한 PBS 솔루션을 추가합니다. 일을 유지하는 것이 중요합니다전자 뇌 조각과 다음 섹션은 완전히이 단계를 통해 PBS에 몰입. </li><li> 상기 vibratome에 트레이를 배치 0.5 mm / 초, 90 Hz의 주파수의 단면, 50 μm의 두께 부분을 수득하기 위해 50 μm의 공급 두께로 절편 속도를 조절한다. 그런 미세한 붓을 사용하여 동결 방지제 용액 (40 % PBS, 30 % 에틸렌 글리콜, 30 % 글리세롤)를 함유하는 20 mL 유리 바이알에 섹션을 옮긴다. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 튜브를 저장합니다. 다음 단계에 설명 된대로 또는 즉시 검사를 위해 PBS에 섹션을 유지합니다. </li></ol> 메 톡시-X04-스테인드 플라크의 존재에 대한 5 절 심사 <ol><li> 정위 마우스 뇌의 지원은 예를 들면 관심 영역을 포함하는 (14) 선택 뇌 부분, 본 실시 예에서 사용 된 해마 CA1 Atlas에서와. 충분히 동결 방지제 용액을 함유하는 24 웰 배양 플레이트 내의 웰에 각 부를 배치수 있도록하는 것은 마르지 섹션을 방지합니다. </li><li> , 섹션을 건조 다음 절차를 사용하지 않도록 연속적으로 각 섹션을 검사 : <ol><li> 일회용 피펫과 현미경 슬라이드에 PBS의 방울을 추가하고 방울 섹션을 배치합니다. </li><li> 메 톡시 X04 표지 Aβ 플라크를 포함하는 영역을 식별하기 위해 형광 현미경 섹션을 검사합니다. 주 : 메 톡시 X04 쉽게 형광 자외선 (UV) 필터 (여기 340-380 나노 미터)을 이용하여 가시화 될 수있다. </li></ol></li><li> 구조적 영역에 직접 플라크의 존재를 연관시키기 위해 각 이미지는 두 필드의 동일한 영역을 표시해야하기 때문에, 현미경 스테이지를 이동하지 않고 시야 관심 (ROI)의 영역의 이미지뿐만 아니라 형광 모드에서 캡처 조직 섹션. </li><li> 저장하고 동물의 수에 따라 촬영 한 이미지의 이름을 지정합니다. 또한 플레이트의 웰 번호와 사진의 분야 TA 기록시야. 예를 들어, 예 : 9978A1B; 동물 번호 : 9978; 그럼 번호 : A1; 이 필드 : 밝은. 이미징이 완료되면 다시 잘 지정에 섹션을 놓습니다. 참고 : 결국, 조사 각 섹션에 대해,이 사진은 밝은 분야에서 하나 UV 분야에서 서로를 얻을 수있다. </li><li> 웰의 수에 따라 이미지 J 동일한 ROI의 두 이미지 (시야에서 하나 UV 필드에서 다른)를 열고 MosaicJ 플러그인을 사용하여 상기 두 이미지의 에지를 정렬 및 정렬과 함께 이미지를 저장 그것을 온. </li><li> 특정 동물의 수에 따라 별도의 폴더에 사진을 저장합니다. 식별 조직 절편에서 플라크 지역화, 두 가지 필드 (밝고 UV)의 전체 부분의 전체 뷰를 가지고 이미지를 결합한다. </li><li> 스크리닝 처리 종료 후 면역 또는 추가 처리는 CA가 될 때까지 동결 방지제를 함유하는 24 웰 배양 플레이트에서 -20 ° C에서 조사 된 부분을 저장할아웃 rried. </li></ol> 6. IBA1에 대한 면역 염색을 중고-포함 참고 : RT에서 천천히 이동 로커에있는 플레이트에 배치하여 선택 자유롭게 부동 섹션에 IBA1에 대한 면역 염색을 수행합니다. <ol><li> 철저 약 1 ml의 PBS, 10 분 동안 지속되는 각각의 세척과 섹션 3 회 씻는다. </li><li> 10 분 동안 PBS 용액에 0.3 % 과산화수소 내인성 퍼 옥시다아제 담금질. 이 단계는 백그라운드 염색을 방지하기 위해 중요하다 비특이적 퍼 옥시 다제 활성을 방지한다. </li><li> 10 분 각각에 대해 PBS에 3 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 PBS 용액에 0.1 % 소듐 보로 하이드 라이드의 섹션을 인큐베이션. 이 단계는 정착 단계에서 남아있는 알데히드를 줄이는 것이 중요하며, 아크롤레인 조직 정착에 사용되는 경우 특히 중요하다. </li><li> 10 분마다 시간 동안 PBS 3 회에서 조직을 씻고 모든 거품을 제거해야합니다. </li><li> 1 시간 동안 절을 차단합니다.다른 항체는 서로 다른 차단 시간 및 솔루션을 필요로 할 수있다. (; pH 7.4의 TBS) IBA1를 들어, 10 % 소 태아 혈청, 3 % 소 혈청 알부민 및 0.01 % 트리톤 X-100의 50 mM 트리스 - 완충 식염수를 함유하는 블록킹 완충액 제조​​. 주 : 차단 단계는 상기 일차 항체의 비특이적 결합을 방지하기위한 것이다. 트리톤 X-100의 낮은 농도는 더 나은 염색 막 약간의 permeabilization을 허용하고, EM에서 조직의 대부분의 미세 기능을 보존 할 정도로 낮다. </li><li> 4 ° CO / N에서 : 조직에서 차단 버퍼를 제거하고 차 항체 용액에 부화 (차단 버퍼 [1000 1] 희석 토끼 항 IBA1). </li><li> 10 분 때마다 TBS에서 3 회 반복한다. </li><li> 90 분 동안 0.05 M TBS에서 : 이차 항체 (비오틴에 접합 된 염소 항 - 토끼) [200 일]을 품어. </li><li> 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다. </li><li> TBS에 아비딘 - 비오틴 복합체 용액 (: [100 (1), 아비딘 비오틴 [100 (1)]) 부화1 시간 동안 솔루션입니다. </li><li> 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다. </li><li> 0.05 %의 디아 미노 벤지딘 (DAB), 8 분 동안 TBS 0.015 % 과산화수소와 IBA1 염색을 보여준다. 주 : DAB 개발 타이밍 프로토콜 프로토콜에 따라 다를 수 있고 신속하게 광학 현미경 하에서 염색 된 부분을 검사하여 결정되어야한다. 참고 : IBA1를 들어, 하나는 (대표 예를 들어 그림 2 참조) 분명 20 배에 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 세포 기관과 프로세스를 시각화 할 수 있어야한다. 이 알려진 발암 물질로, DAB를 사용하여주의하십시오. </li><li> 위에서 설명한대로 조심스럽게이 단계에서 섹션을 모니터링하여 이상 현상 마십시오. 5 분마다 시간 동안 냉장 PB 5 번 섹션을 세척하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 전자 현미경 7. 처리 <ol><li> 유리 병에 PBS에 1 % 산화 오스뮴 솔루션을 준비합니다. 사 산화 오스뮴은 감광성이고; g을 커버알루미늄 호일 아가씨 유리 병은 빛의 솔루션을 보호 할 수 있습니다. 그것은 매우 위험한 화학 물질로 산화 오스뮴을 사용하여주의하십시오. 이것과 흄 후드 내에서 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> 섹션에서 PBS를 제거하고 평판 좋은 붓을 사용하여 확산. 마르지 섹션을 유지하기 위해 한 번에이 단계를 잘 하나를 수행합니다. 즉시 섹션에있는 주름을 영구적으로 될 것 같은, 산화 오스뮴을 추가 만 섹션을 깰 것이다 조직 포스트 오스뮴 고정을 평평하게하기 전에 부분을 평평하게해야합니다. </li><li> 겹치지 섹션을 방지하기 위해 전달 피펫 동시에 산화 오스뮴 한 방울을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 산화 오스뮴의 섹션을 담근다. 빛의 섹션을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 잘 커버. 참고 :이 단계는 섹션 내에서 지질를 해결합니다. 조직은 오스뮴 후 고정 후 매우 어두운 표시됩니다. </li><li> 섹션 오스뮴 테트에있는 동안xide은 20 g의 성분 A를 혼합하여 일회용 비이커에 플라스틱 수지를 제조 20 g 성분 B, 0.6 g 성분 C 0.4 g 성분 D. 상기 순서로 성분들을 함께 결합하고 또한 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 혼합 까지 균일 한 색이 얻어진다. </li><li> 알루미늄 무게 요리로 준비된 혼합물을 전송합니다. 그들은 탈수 한 후 그들은 조직 절편을 받게됩니다. </li><li> 35 %, 35 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 % 다음의 순서로 2 분 동안 에탄올 농도 증가의 섹션 탈수. </li><li> 2 분 때마다 3 회, 잔류 에탄올을 제거 프로필렌 옥사이드의 섹션을 빠져들게합니다. 20 ㎖ 유리 병에 24 웰 배양 판에서 탈수 섹션을 제거합니다. 항상 플라스틱을 용해로 프로필렌 옥사이드로 작업 할 때 유리 병을 사용하고 유해 한,주의를 유지한다. </li><li> 프로필렌 옥사이드 soluti에서 섹션을 전송하는 구부러진 유리 피펫 팁 또는 벌금 붓을 사용하여수지에과에하면 RT에 침투하기위한 O / N 두십시오. 프로필렌 옥사이드와 수지를 희석하지 않도록주의하십시오. </li><li> 폴리 클로로 트리 플루오로 에틸렌 (PCTFE) filmsheets의 수지 부분을 포함 : <ol><li> PCTFE의 filmsheets에 섹션을 삽입하기 전에 15 분 - 10 60 ° C 오븐 - 50로 표본을 포함하는 알루미늄 무게 요리를 놓습니다. </li><li> 섹션을 포함하는 경우, 하나의 알루미늄 한 번에 요리 무게와 함께 작동합니다. 미세 붓을 사용하여, 하나의 PCT​​FE 필름 시트 상 수지 박막 페인트. </li><li> PCTFE 필름 시트에 접시 무게 알루미늄에서 한 번에 조직의 한 부분으로 이동합니다. 그것을 방해하지 않도록주의, 조직 주위에서 초과 수지를 제거합니다. </li><li> PCTFE 필름 시트 접시 무게 하나에서 모든 섹션을 이동 한 후, 조직의 샌드위치를​​ 만드는 첫 번째 통해 두 번째 PCTFE 시트를 배치하고 2 시트 사이에 수지. </li></ol></li><li> (5)에서 3 일 동안 항온 수지를 중합5-60 °의 C. </li><li> 소재는 지금 초박막 절편과 미세 검사, 자주 EM 핵심 시설에 의해 수행되는 전문 기술에 대한 준비가되어 있습니다. 미세 저하없이 실온에서 안전하게 PCTFE 필름 시트 사이의 샘플을 저장합니다. 참고 초박 절편 및 전송 전자 현미경 검사를위한 후속 단계는 별도의 프로토콜 (13)에 설명되어있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 EM과 고밀도 코어 Aβ 플라크를 대상에 대한 상호 접근 방법을 설명합니다. 생체 내 주입에 톡시 - X04은 예를 들어, 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare을 Aβ의 특정 지역 내 플라크와 관심의 층을 포함하는 뇌 부분을 신속하게 선택할 수 있습니다. 본 예에서, 메 톡시 X04 사전 심사는 소교 표현형은 고밀도 코어 Aβ 플라크의 존재 하에서 미세 수준에서 시냅스와 상호 작용하...

아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크 형성은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 신경 병리학 적 특징이다. 그러나 증거가 증가 질병 진행 1,2-에서 면역계의 중요한 역할을 시사한다. 특히, 전임상 및 임상 시험의 새로운 데이터는 AD 병리에 대한 기본 드라이버와 기여 면역 기능 장애를 설립했다. 이러한 연구 결과를 통해, 중추 및 말초 면역 세포는 AD 3으로 유망한 치료 목표를 등장했습니다. 다음 프로토콜은 아밀로이드 베타 플라크 증착 및 AD에서 소교 표현형 변화 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 생성하는 빛과 전자 현미경 (EM)을 결합한다. 이 프로토콜은 형광 염료 메 톡시 X04의 생체 내 주입에 사용 AD의 마우스 모델에서 Aβ 플라크의 표시를 할 수 있습니다. 메 톡시 X04 쉽게 뇌 실질을 입력 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 높은 β-와 주름진 시트를 결합 할 수있는 콩고 레드 유도체ffinity. 형광 염료이기 때문에, 두 개의 광자 현미경 4 Aβ 플라크 침착의 생체 내 검출을 위해 사용될 수있다. 일단 Aβ에 결합, 메 톡시 X04은 해리 또는 플라크에서 멀리 재배포, 그것은 시간이 지남에 따라 그 형광을 유지하지 않습니다. 일반적으로 뇌 역학 (5)의 비 침습성 영상화를 허용하는 주변으로 투여된다. 형광도 상관 사후는 Aβ 플라크 (6) 부근의 신경 세포의 죽음에 대한 조사를 포함하여, 분석을 허용 알데히드 고정 다음 남아있다. Aβ을 나타내는 7 (APP 유전자 Lys670Asn / Met671Leu에서 이중 돌연변이를 coexpressing, 인간의 프레 PS1-A264E 변형 APP-PS1)이 프로토콜은 APP SWE / PS1A 246E 마우스에서 뇌 섹션을 선택 메 톡시 X04의 특성을 활용 특정 관심 영역 (해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에 플라크) 소교 세포 기관 및 EM과 프로세스를 시각화)가 소교 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (IBA1에 대한 면역 염색을 임베딩 사전하기 전에. 생쥐는 transcardial 관류를 통해 24 시간 이전에 뇌 고정에 메 톡시 X04 솔루션의 복강 내 주사 주어집니다. 코로나 뇌 섹션은 vibratome를 사용하여 얻을 수있다. 해마 CA1을 포함하는 섹션은 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에서 Aβ 플라크의 존재에 대한 형광 현미경으로 상영된다. IBA1 면역 염색, 산화 오스뮴 후 고정하고, 플라스틱 수지 매립는 선택된 뇌 구역에서 수행된다. 이 프로토콜의 끝에서, 섹션은 초박 절편 및 미세 시험에 대한 준비가 더 미세 저하없이 보관할 수 있습니다. 중요한 것은, 플라크는 여전히 본 프로토콜로 인스턴스 IBA1를 들어, 다른 항체와 면역 염색 후 형광등된다. 그들은 어두운 t이 될한 산화 오스뮴 후 고정 다음 그 주변 neuropil는 독립적으로 정확하게 몇 평방 밀리미터 일반적으로 아래의 관심 영역을 식별하는 데 도움이 메 톡시 X04 염색의 투과형 전자 현미경으로 검사한다. 이 상호 접근은 미세 수준에서 조사하는 뇌의 특정 부분을 식별 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 단지 조직 절편의 작은 분획에 존재하는 약간의 Aβ 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 특히,이 시간 동안, 단순히 적절한 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 분획을 수득 몇몇 뇌 부분에 (예 IBA1 다른 세포 마커 및 이중 라벨링) Aβ에 대한 면역 염색을 사용하는 것이 비효율적 일 수있다. 메 톡시 X04 라이브 마우스 또한, 사출 희생 및 조직 처리 compromis을하지 않습니다하기 전에미세 구조 보존 전자. 이러한 고정 된 조직 섹션에 콩고 레드, Thioflavin S, Thioflavin T 또는 메 톡시 X04와 사후 염색 등의 다른 방법은 에탄올 염색 차별화, 삼투 스트레스의 원인과 미세 구조를 방해 8-11을 필요로한다. 콩고 레드는 알려진 발암 물질 (12)이다.

<table><tbody><tr><td>Methoxy-X04</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4920</td><td>10 mg substrate per tablet</td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W294004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Caution: toxic</td></tr><tr><td>Sodium Chloride NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP153500</td><td></td></tr><tr><td>Acrolein</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Granular</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher</td><td>09-790-14F</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump with Tubing</td><td>ColeParmer</td><td>cp.78023-00</td><td></td></tr><tr><td>Excel Winged blood Collection Set Needles 25&amp;nbsp;G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367341</td><td></td></tr><tr><td>Extrafine Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11152-10</td><td>Tip shape: curved</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14090-09</td><td>Tip shape: straight</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>F.S.T</td><td>13003-10</td><td>Tip shape: curved</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14004-16</td><td>Tip shape: straight</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>ROBOZ surgical store</td><td>5818</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>74515-20</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>14047235612</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>71990</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>24-well Tissue Culture Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP230-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide, 30%</td><td>J.T.BAKER</td><td>cat: 2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001H24</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anti IBA1, Rabbit&amp;nbsp;</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111066046</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>3.3&#039;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905-50TAB</td><td>Caution: toxic</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide, 4% solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td>Caution: toxic</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM single component A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td>Resin Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM single component B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td>Hardener Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM single component C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td>Plasticizer Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM single component D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td>Accelerator Caution: Toxic</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>LesAlcoolsdeComerce</td><td>151-01-15N</td><td></td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma</td><td>110205</td><td>Caution: corrosive</td></tr><tr><td>Aluminum weigh dishes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>ACLAR&amp;reg;&amp;ndash;Fluoropolymer Films</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>Oven/Incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

상세한 프로토콜은 이전에 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 섹션 아밀로이드 Aβ 플라크를 식별하기 위해 여기에서 제공되는 미리 매립 면역 및 조직 처리 (구체적으로는 이온화 된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 미세 아교 세포에 의해 발현되는 칼슘 결합 단백질) 전자 현미경 (EM). 메 톡시 X04은 고밀도 코어 Aβ 플라크에서 발견 된 β-주름 시트에 바인딩 선택적으로 혈액 - 뇌 장벽을 통과하고 형광 염료입니다. 메 톡시 X04과 동물의 주입 전에 희생 뇌 고정 미리 선별하고 시간 소모적 인 조작으로 추가 처리를 위해 플라크 함유 뇌 구간 선택을 허용한다. 섹션의 작은 분획에 존재하는 거의 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 콩고 레드, Thioflavin S, 및 Thiofl와 조직 섹션의 사후 처리AVIN의 T (또는 메 톡시 X04과)는 β-주름 시트 레이블을하지만, 여분의 염료를 제거하기 위해 에탄올 광범위한 청산이 필요하며 이러한 절차는 미세 보존과 호환되지 않습니다 수 있습니다. 또한 단지 올바른 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 부분을 산출하기 위해, Aβ (및 IBA1 같은 다른 세포 마커) 관심있는 지역의 모든 뇌 부분에 대한 표시를 수행하는 비효율적 인 것입니다. 중요한 것은, Aβ 플라크는 전자 현미경으로 검사 할 영역의 정확한 식별 (일반적으로 몇 평방 밀리미터에 이르기까지)을 허용, EM을위한 조직 처리 후에도 볼 수 있습니다.

이 섹션은 프로토콜의 다른 중요한 단계에서 획득 할 수있는 결과를 나타낸다. 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare : 특히 결과는 뇌 메 톡시 X04 스테인드 특정 지역에 플라크와 관심 층을 포함하는 섹션의 예를 보여줍니다. 플라크 및 해마의 라멜라 / 지방 조직은 연속 UV 밝은 필드 필터 (도 1)의 조합을 사용하여 가시화된다. 선택된 뇌 섹션 이후 면역 염?...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K 조회수.  CHU de Québec Research Center.  이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다. 

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Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

연구

생화학

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

생체공학

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible for phagocytosis and clearance of debris and detritus. These cells include CNS-resident macrophages known as microglia, and mononuclear phagocytes infiltrating from the periphery. Light microscopy has generally been used to visualize phagocytosis in rodent or human brain specimens. However, qualitative methods have not provided definitive evidence of in vivo phagocytosis. Here, we describe quantitative 3D in silico modeling (q3DISM), a robust method allowing for true 3D quantitation of amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent Alzheimer&#39;s Disease (AD) models. The method involves fluorescently visualizing A&#946; encapsulated within phagolysosomes in rodent brain sections. Large z-dimensional confocal datasets are then 3D reconstructed for quantitation of A&#946; spatially colocalized within the phagolysosome. We demonstrate the successful application of q3DISM to mouse and rat brains, but this methodology can be extended to virtually any phagocytic event in any tissue.

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

We developed a methodology for quantitative 3D in silico modeling (q3DISM) of cerebral amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent models of Alzheimer&#39;s disease. This method can be generalized for the quantitation of virtually any phagocytic event in vivo.

양적 3D<em&gt; 인 실리코</em알츠하이머 병의 쥐 모델에서 뇌 아밀로이드 - 베타 탐식&gt; 모델링 (q3DISM)

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

의학

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

신경과학

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

면역학 및 감염병학

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

Two-Photon Microscopy for Studying Microglial Process Attraction Toward a Compound in a Mouse Brain Slice

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58788/two-photon-imaging-microglial-processes-attraction-toward-atp-or'>Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices.&#160;J. Vis. Exp. (2019)</a>This video demonstrates the use of two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward an injected compound in brain slices. It provides an overview of preparing mouse brain slices, injecting a chemoattractant test compound, and imaging fluorescently labeled microglia to visualize their responses.

Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices.&#160;J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Live Imaging & In Vivo Tracking

Analyzing Amyloid Structures in a Tissue Section Using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

On the day of staining, immerse the sections in consecutive baths of 99% ethanol, 70% ethanol, dH_2O, and PBS for 10 minutes each time, then allow the tissue sections to dry under ambient conditions. While the tissue dries, prepare a working solution of HFTAA by diluting the stock 1 to 10,000 in PBS. When the tissue is dry, add droplets of the HFTAA working solution to each tissue section to cover it. Incubate for 30 minutes at room temperature.Rinse off the staining solution with 500 microliters of PBS, and then immerse the slide in the PBS bath for 10 minutes. After allowing the section to dry under ambient conditions, mount using fluorescence mounting medium. Allow the mounting medium to settle overnight.Amyloid detection can be performed directly after mounting or even without mounting. However, if the goal of the experiment is to collect high-quality spectral information, overnight incubation is preferred.Switch the microscope to FLIM mode, set the pinhole to 20, the excitation wavelength to 490 nanometers, and the laser intensity to 0.5%. Use pulsed lasers at 40 megahertz. In the FLIM software, set up photon counting over 550 nanometers. In the Display Parameters window, follow the photon counting until the max count is around 4,000 photon counts. Save the file and export it as SPC image.

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

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