이 부피 전자 현미경 기술은 3-D 구조의 관찰을 요구하는 생물학 연구를 능력을 발휘하기 위하여 이용됩니다. 이미지를 다시 보기 전에 로드, 필더 뷰 및 샘플 저장소를 제공합니다. Fx2 Asan은 타깃 구조물의 전자 시험을 증가시키기 위하여 디아빌레이션을 촉매하고 관심있는 특정 표적을 찾아내는 데 사용될 수 있는 경로 단계를 설계했습니다.
이 입자는 관상 동맥 및 호스트 세포 사이 상호 작용을 조사하기 위하여 상대성 빛 및 3-D 전자 현미경 기술의 사용을 결합합니다. 이식 후 16~24시간, 섭씨 30~37도의 250마이크로리터로 컬쳐를 부드럽게 세척합니다. 세척을 신선한 고정 용액 1.5 밀리리터로 신속하게 교체하고 문화를 얼음에 30 분 동안 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 세척당 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼의 1 밀리리터로 31분 세척으로 세포를 헹구는 다. 마지막 세척 후, 얼음 차가운 0 ~4도 20 밀리머 글리신 용액1 밀리리터를 얼음에 10 분 동안 접시에 넣고 1 밀리리터를 얼음에 넣고 1 밀리리터를 씻어 내고, 세척당 1 밀리리터의 신선하고 차가운 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼로 3 밀리리터를 씻어 넣습니다. 다음으로, 갓 준비된 DAB 용액 500마이크로리터로 셀에 라벨을 붙입니다.
그리고 약 5 ~45 분 동안 얼음에 세포를 배양. 밝은 갈색 얼룩이 반전 된 빛 현미경으로 볼 때, 세척 당 10 분 동안 신선한, 차가운 0.1 어금니 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세 번 헹구세요. 이어서, 위상 대비 반전 현미경을 사용하여 DAB 염색을 100배 이상으로 시각화하고 관심 영역이 있는 유리의 바닥을 표시한다.
전자 현미경 블록 샘플 제제의 경우, 먼저 섭씨 4도에서 1 시간 동안 2 %의 1 밀리리터로 세포를 수정합니다. 고정이 끝나면 세워서 3개의 5분간 세척하고 세척당 신선한 증류수 1밀리리터로 세포를 헹구습니다. 20 분 동안 여과 된 TCH 용액의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에.
인큐베이션이 끝나면, 단지 입증된 대로 증류수에서 세포를 세 번 씻고 2% 감소된 오스뮴 테트산화물에서 30분 배양으로 세포를 고정시한다. 두 번째 고정의 끝에서, 증류수로 세포를 세 번 세척하고 빛으로부터 보호 섭씨 4섭씨에서 하룻밤 수성 1 %uranyl 아세테이트의 1 밀리리터로 문화를 커버. 다음 날 아침, 60도의 1밀리리터로 스테인싱하기 전에 증류수로 셀을 세 번 씻은 후 60도 오븐에서 30분 동안 월튼의 납 아스파트로 사용할 수 있습니다.
인큐베이션이 끝나면 증류수로 셀을 세 번 씻으실 수 있습니다. 그리고 20 분 2 밀리리터 에탄올 알리 쿼트의 등급 시리즈에서 문화를 배양. 마지막 100% 에탄올 노출 후, 실온에서 혼합물 매체를 낮은 점도 에탄올에 3-1의 1 밀리리터에서 30분 동안 세포를 배양한다.
인큐베이션의 끝에서, 저점도 에탄올의 1 밀리리터로 배지를 실온에서 30분 간 배양하는 혼합물 배지로 교체한다. 다음으로, 저점도 포함 혼합물 배지에 1-3 에탄올의 1밀리터로 배지를 실온에서 30분 간 추가로 교체한다. 이어서, 배지를 100% 낮은 점도 포함 매체의 1밀리리터로 교체하고, 그 다음에 는 60°C에서 24시간 동안 100% 낮은 점도 포함 혼합물에 샘플을 포함시키는 것이다.
전송 전자 현미경 분석을 위해, 다음 날, 초미세 토메를 사용하여 90 나노미터 두께의 단면을 얻고 200 킬로볼트에서 투과 전자 현미경 검사법의 밑에 그리드를 관찰하십시오. 시료 준비를 시작하기 전에, 30~60초 동안 이소프로파놀에 부드러운 교반으로 인듐 틴 옥사이드 코팅 유리 커버립을 세척합니다. 동요의 끝에서, 여분의 알코올을 배출하고 먼지가없는 환경에 커버립을 배치합니다.
커버립이 건조하면 플라즈마 코터를 사용하여 1분 동안 커버립을 배출합니다. 그런 다음 커버립을 기판 홀더에 삽입하고 기판 홀더를 칼 보트에 넣습니다. 전자 현미경 검사용 샘플을 얻으려면 내장된 샘플 블록을 초미세토메의 샘플 홀더에 삽입합니다.
그리고 트리밍 블록에 홀더를 설정합니다. 면도날을 사용하여 블록의 면이 사다리꼴 또는 직사각형 모양을 획득하도록 대상 위치 주위의 과잉 수지를 다듬습니다. 선행 및 후행 가장자리는 서로 엄격하게 평행해야 합니다.
많은 수의 일련 섹션을 획득하는 것은 쉽지 않습니다. 그러나 선행 가장자리와 후행 모서리가 완전히 평행해야 합니다. 다음으로, 초미세토메의 암에 샘플 홀더를 삽입한다.
다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 놓고 칼보트를 여과된 증류수로 채웁니다. 그런 다음 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 캐리어 위치를 조정하여 커버의 가장자리가 칼에 가깝도록 합니다. 샘플을 얻은 후 단면 공정을 멈추고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트를 배출하십시오.
리본 수집 프로세스가 완료되면 클램핑 장치의 핸들로 기판을 제거하고 리본을 건조시다. 관심있는 단백질을 표현하는 유전 태그 플라스미드의 사용은 태그 된 단백질에 대한 염색 후 전염 된 표적 세포의 식별을 허용합니다. 코르상대광 전자 현미경 검사는 표지된 세포 배양을 더 시각화하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, SCO1-APEX2에 의해 생성된 어두운 얼룩은 미토콘드리아의 매트릭스 공간이 아닌 미토콘드리아 간 공간에서 독점적으로 관찰된다. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드를 모두 가진 코드 전염된 세포는 미토콘드리아 막 공간과 내시경 망상에서 고밀도 전자 신호를 나타낸다. 그러나, SCO1-APEX2로만 전염되는 세포에서는 뇌성 망상 염색이 관찰되지 않는다.
전자 현미경 검사를 스캔하여 직렬 이미징의 경우 넓은 영역에 백스캐터 전자 검출기를 사용하여 전체 어레이 이미지에 대한 개요가 만들어집니다. 다음으로 관심 영역은 첫 번째 섹션에 배치되고 다른 모든 섹션에 전파됩니다. 마지막으로, 5개의 표적 세포를 포함하는 관심 영역은 5나노미터 이미지 픽셀로 심화된다.
배율은 골기 장치, 미토콘드리아 및 종말 망상과 같은 상세한 세포 극체 구조를 보여줍니다. 연쇄 화상 진찰은 명확하게 풍요의 망상 -미토콘드리아 접촉이 다른 z-비행기에서 발생한다는 것을 보여줍니다. 특정 ID 수정의 효과를 조사하기 위해 상대성 광 및 전자 현미경 검사를 사용하여 특정 표적 구조를 찾는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
이 염색 기술은 부피 전자 현미경 검사법과 결합된 더 큰 규모의 EM을 위해 특히 eurovirus에서 세포 상호 작용을 조사하는 데 사용될 수 있었습니다. 글루타랄데히드, 또한 엔테에테르시드와 TCH는 매우 독성이 있으므로 보호복을 착용하고 이러한 재료를 사용할 때 연기 후드에서 작동해야합니다.
