지구 온도가 계속 상승함에 따라 열 한계와 순응 및 개체 발생과의 관계를 정량화하는 것은 미래의 온난화에 대한 종의 취약성을 결정하는 데 필수적입니다. 복잡한 생명 역사를 가진 해양 생물의 경우 열 한계를 결정하는 것은 논리적으로 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 작은 플랑크톤 유기체의 임계 온도를 추정하는 방법을 구축하기 쉽고 작은 설치 공간을 소개합니다.
이 방법은 밀리미터 크기의 플랑크톤 미만의 작은 것을 위해 개발되었지만 약 50 밀리리터 부피의 섬광 바이알에 맞는 더 큰 해양 생물에 채택 될 수 있습니다. 스트립 히터를 가변 저항기에 배선하여 시작하십시오. 6 x 10 크기의 그리드에 60 개의 구멍을 뚫어 20.3 x 15.2 x 5cm 크기의 알루미늄 블록을 준비하고 구멍이 양방향으로 중심에서 중앙으로 2cm 간격으로 있는지 확인하십시오.
첫 번째와 두 번째 열, 아홉 번째와 10번째 열 사이에 두 개의 추가 구멍을 뚫어 온도 컨트롤러 프로브의 크기와 일치시킵니다. 요소를 제자리에 고정하고 완성 된 열 블록을 단열하려면 투명 아크릴 시트로 케이스를 구성하여 발열체 뒷면에 두 개의 레이어를 적용하십시오. 최종 조립에서 열 페이스트를 적용하여 발열체에서 블록으로, 블록에서 냉각 요소로의 열전도율을 최대화합니다.
수조를 Tygon 튜브로 연결하고 온도 조절기 프로브를 알루미늄 블록 측면의 구멍에 삽입합니다. 밀링 된 모든 구멍에 수돗물로 채워진 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 가장자리에 놓습니다. 온도 컨트롤러를 켜고 프로브 1의 정지 가열 온도를 섭씨 35도에서 37도로, 프로브 2를 섭씨 21.5도에서 22.5도로 설정합니다.
가변 저항기를 돌려 발열체를 켜고 중간으로 설정하십시오. 수조를 켜고 냉각기 온도를 섭씨 15도로 설정합니다. K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 이후 10분마다 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인합니다.
필요에 따라 온도 조절기와 수조의 설정을 변경하여 끝점의 값을 조정합니다. 재순환 수조와 히터를 켜고 각각 섭씨 15도, 섭씨 37도로 설정하여 섭씨 19.5도에서 섭씨 37도까지의 온도 구배를 생성합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 밀링 된 구멍에 넣고 열 블록의 온도에 도달하면 K 형 전극이있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심 분리 튜브 내부의 온도를 확인하십시오.
그리고이 온도를 기록해 두십시오. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 바닷물로 채우고 0.45 마이크로 미터 메쉬를 통해 여과합니다. 역여과로 연구 유기체의 배양을 농축하여 유기체가 비커의 바닥에 남아 있도록 합니다.
농축된 배양액을 여과된 해수로 헹구고, 역여과를 한 번 더 반복하여 시료를 농축한다. 해부 현미경으로 작은 플랑크톤 유기체를 세고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 알려진 수의 유기체를 반쯤 채워진 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 이제이 튜브의 최종 부피가 1 밀리리터에 도달 할 때까지 여과 된 해수를 추가하십시오.
이제이 튜브를 쌍으로 가열 블록에 넣고 차가운 끝에서 시작하여 유기체가 원하는 실험 온도까지 점차적으로 예열 할 수 있도록합니다. 10분 동안 기다렸다가 마이크로 원심분리기 튜브 쌍을 더 따뜻한 온도의 인접한 천공 구멍으로 옮깁니다. 콜드 엔드의 각 행에 추가 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 배치하고 쌍으로 따뜻한 끝쪽으로 계속 이동하십시오.
전체 블록이 채워지면 지정된 온도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 잠복기가 끝나면 각 튜브의 온도를 측정하고 기록해 두십시오. 그런 다음 모든 튜브를 사전 라벨링된 홀더로 옮기고 회수할 수 있도록 미리 결정된 온도에서 1시간 동안 배양합니다.
살아있는 유기체 부분을 열거하기 위해, 유리 피펫을 사용하여 35mm 페트리 접시에 개별 마이크로 원심 분리 튜브의 내용물을 옮깁니다. 해부 현미경으로 살아있는 유기체와 죽은 유기체를 세고 숫자를 기록하십시오. 관찰 된 유기체의 수는 원래 취한 유기체와 일치해야합니다.
그렇지 않은 경우 마이크로 원심 분리기 튜브와 페트리 접시의 측면을 확인하고 관심있는 헤더 그룹화 변수, 섭씨 온도 단위의 튜브 온도, 살아있는 개인 수 및 사망 한 개인 수와 함께 CSV 형식의 데이터 테이블을 생성합니다. 로지스틱 회귀 분석으로 데이터를 피팅하려면 이항 분포가 있는 일반화 선형 모형을 사용하십시오. 모델을 실행하려면 source를 입력하고 R 파일 modelloop.r을 사용합니다.
개체의 50%가 생존한 예측 변수 값을 계산하여 열 상한의 중앙값을 결정합니다. 이 프로토콜을 사용하여 수정 후 2, 4 및 6 일에 섭씨 19도에서 37 도의 온도 범위에 걸쳐 유충 모래 달러의 생존을 측정했습니다. 유충 모래 달러가 발달함에 따라 열 상한은 수정 후 2 일 섭씨 28.6도에서 수정 후 4 일 섭씨 28.8도, 수정 후 6 일 섭씨 약 29도까지 증가했습니다.
배양 및 회복 시간은 종에 따라 다릅니다. 선택한 타이밍이 신뢰할 수 있는 라이브 대 데드 추정을 산출하는지 확인하기 위해 예비 테스트를 수행하는 것이 중요합니다.
