A medida que las temperaturas globales continúan aumentando, la cuantificación de los límites térmicos y la relación con la aclimatación y la ontogenia son vitales para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. Para los organismos marinos con historias de vida complejas, determinar los límites térmicos puede ser un desafío logístico. Este protocolo introduce un método de huella pequeña y fácil de construir para estimar las temperaturas críticas de pequeños organismos planctónicos.
Si bien el método se desarrolló para plancton pequeño, de menos de un milímetro de tamaño, se puede adoptar para organismos marinos más grandes que cabrían en viales de centelleo de aproximadamente 50 mililitros de volumen. Comience cableando el calentador de tiras al reóstato. Perfore 60 agujeros en una cuadrícula de tamaño de seis por 10 para preparar el bloque de aluminio de un tamaño de 20.3 por 15.2 por cinco centímetros, y asegúrese de que los agujeros estén espaciados dos centímetros de centro a centro en ambas direcciones.
Perfore dos orificios adicionales entre la primera y la segunda columna y la novena y 10ª columna, que coincidan con el tamaño de las sondas del controlador de temperatura. Para mantener los elementos en su lugar y aislar el bloque térmico completo, construya una caja con láminas de acrílico transparente, asegurándose de aplicar dos capas en la parte posterior del elemento calefactor. En el ensamblaje final, aplique pasta térmica para maximizar la conductancia térmica del elemento calefactor al bloque y del bloque al elemento refrigerante.
Conecte el baño de agua con el tubo Tygon e inserte la sonda del termostato en los orificios en el lado del bloque de aluminio. En todos los orificios fresados, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, llenos de agua del grifo hasta el borde. Encienda el controlador de temperatura y ajuste la temperatura de calentamiento de parada de la sonda uno a 35 a 37 grados centígrados, y la sonda dos a 21,5 a 22,5 grados centígrados.
Gire el reóstato para encender el elemento calefactor y configúrelo en medio. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del enfriador a 15 grados centígrados. Usando un termopar con un electrodo tipo K, verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga cada 10 minutos después.
Ajuste los valores de los puntos finales cambiando la configuración del controlador de temperatura y el baño de agua según sea necesario. Encienda el baño de agua de recirculación y el calentador y configúrelos a 15 grados centígrados y 37 grados centígrados respectivamente, para generar un gradiente de temperatura de 19,5 grados centígrados a 37 grados centígrados. Una vez que los tubos de microcentrífuga se colocan en orificios fresados y se alcanza la temperatura del bloque de calor, verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga utilizando un termopar con un electrodo tipo K.
Y anote estas temperaturas. Llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con agua de mar, filtrada a través de una malla de 0,45 micrómetros. Concentrar el cultivo del organismo de estudio con filtrado inverso para que los organismos permanezcan en el fondo del vaso de precipitados.
Enjuague el cultivo concentrado con agua de mar filtrada y repita el filtrado inverso una vez más para concentrar la muestra. Contar los pequeños organismos planctónicos bajo un microscopio de disección y transferir un número conocido de organismos a tubos de microcentrífuga medio llenos utilizando una pipeta pasteur de vidrio. Ahora agregue agua de mar filtrada hasta que el volumen final en estos tubos alcance un mililitro.
Ahora coloque estos tubos en pares en el bloque de calentamiento, comenzando desde el extremo frío para permitir que los organismos se calienten gradualmente a la temperatura experimental deseada. Espere 10 minutos y mueva los pares de tubos de microcentrífuga a los orificios perforados adyacentes con temperaturas más cálidas. Coloque pares adicionales de tubos de microcentrífuga en cada fila en el extremo frío y continúe desplazándolos hacia el extremo más cálido en pares.
Una vez que todo el bloque esté lleno, incubarlo durante dos horas a la temperatura designada. Al final del período de incubación, mida la temperatura en cada tubo y anótela. Luego transfiera todos los tubos a los soportes preetiquetados e incubarlos a una temperatura predeterminada durante una hora para permitir la recuperación.
Para enumerar la porción del organismo vivo, transfiera el contenido de un tubo de microcentrífuga individual en una placa de Petri de 35 milímetros utilizando una pipeta de vidrio. Bajo un microscopio de disección, cuente los organismos vivos y muertos y anote los números. El número observado de organismos debe coincidir con el organismo tomado originalmente.
Si no es así, compruebe el lado de los tubos de microcentrífuga y la placa de Petri, Genere una tabla de datos en formato CSV con las cabeceras agrupando variables de interés, la temperatura del tubo en grados centígrados, el número de individuos vivos y el número de individuos muertos. Para ajustar los datos con una regresión logística, utilice un modelo lineal generalizado con una distribución binomial. Para ejecutar el modelo, escriba source y utilice el archivo R, modelloop.r.
Calcular los valores predictores en los que sobrevivió el 50% de los individuos, para determinar el límite térmico superior medio. Usando este protocolo, se midió la supervivencia de los dólares de arena larval, que estaba en un rango de temperatura de 19 a 37 grados centígrados, a los dos, cuatro y seis días después de la fertilización. A medida que se desarrollaban los dólares de arena larval, el límite térmico superior aumentó de 28.6 grados centígrados a los dos días posteriores a la fertilización, a 28.8 grados centígrados a los cuatro días después de la fertilización, y aproximadamente 29 grados centígrados a los seis días después de la fertilización.
Los tiempos de incubación y recuperación son específicos de cada especie. Es importante realizar una prueba preliminar para garantizar que el tiempo seleccionado produzca una estimación confiable de vivos versus muertos.
