인간 배아에 대한 연구는 낮은 가용성과 윤리적 인 우려로 인해 제한되므로 초기 인간 발달을 충실하게 복제하는 개별 모델을 얻는 것은 과학 및 의학적 진보를 지원할 것입니다. 인간 발달을 예측하는이 기술의 능력은 발달 순서와 속도에 따라 배반포 세포 결정 및 형태 형성의 서열을 효과적으로 재현 할 수있는 능력에 달려 있으며, 그러한 모델링은 배반포 단계를 진정으로 반영하는 세포의 형성을 보장 할 것입니다. 미래에, 인간 블라스토이드는 치료 표적을 확인하고 전임상 모델링에 기여하기 위해, 예를 들어, 시험관내 수정 매질을 개선시키거나, 비호르몬 피임약을 개발하는데 사용될 수 있다.
절차를 시연하는 것은 Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer, Giovanni Sestini입니다. 시작하려면 PXGL 배지, N2B27 기본 배지, 세척 완충액, PBS 및 응집 배지를 준비하고 예열합니다. 블라스토이드 형성을 위해 hPSC 현탁액으로부터 MEF를 배제한다.
MEF 배제를 위해, 6웰 플레이트의 웰에 0.1%젤라틴 1밀리리터를 첨가하여 젤라틴 코팅 플레이트를 준비한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 30 내지 90분 동안 인큐베이션한다. 세포를 수확하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 한 밀리미터의 PBS로 세척하였다.
500 마이크로리터의 세포 분리 용액을 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 인큐베이션한다. 세포를 현미경으로 확인하여 콜로니를 단일 세포로 해리시킨다. 세포 분리 용액을 한 밀리리터의 세척 완충액으로 희석하십시오.
다섯 번 내지 10회 부드럽게 피펫팅하여 플레이트로부터 세포를 수집한다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 4분 동안 200 RCF에서 회전시킨다.
상청액을 제거하고, 세포를 각 웰에서 1.5 밀리리터의 PXGL 배지에 재현탁시켰다. MEF 배제를 위해 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 세포를 시드하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 60 내지 90분 동안 인큐베이션한다. 일단 순진한 세포가 MEF 배제를 위해 시딩되면, 마이크로웰스로부터 PBS를 제거하고, 웰을 각 마이크로웰 칩에 대해 200 마이크로리터의 기저 N2B27 배지로 평형화시키고, 섭씨 37도에서 60분 동안 인큐베이션한다.
부착되지 않은 순진한 세포를 포함하는 상청액을 수집하십시오. 그것을 15 밀리리터 튜브로 옮기고, 세포를 200 RCF에서 4 분 동안 스핀 다운시킨다. 배지를 폐기하고, 세포를 N2B27 기저 배지의 한 밀리리터에 재현탁시킨다.
셀 카운팅 슬라이드를 사용하여 셀 카운트를 계산합니다. 세포를 4분 동안 200 RCF에서 회전시킨다. 배지를 버리고, 10 마이크로몰 Y27632를 함유하는 적절한 양의 N2B27 배지를 첨가하여 50 마이크로리터 당 30, 000 세포의 세포 밀도를 얻었다.
평형화된 MicroWell 어레이에서 배지를 제거하고 10 마이크로몰 Y27632로 25 마이크로리터의 N2B27 배지를 첨가한다. 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가하고, 세포가 MicroWell의 바닥으로 떨어질 수 있도록 섭씨 37도에서 15분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 125 마이크로 리터의 N2B27 배지를 넣고 10 마이크로 몰 Y27632로 보충하십시오.
24시간 이내에 MicroWell 칩에서 순진한 hPSC의 응집체가 관찰됩니다. PALY 배지를 제조함으로써 블라스토이드 형성을 개시한다. 섭씨 37도에서 30 분 동안 미리 따뜻하게하십시오.
응집 배지를 제거하고, 200 마이크로리터의 예열 PALY 배지를 MicroWells에 첨가한다. 세포 배양 플레이트를 다시 섭씨 37도의 저산소 인큐베이터에 넣는다. 첫날에 미디어 변경을 반복하십시오.
둘째 날에, PALY 배지를 제거하고, LPA 및 10 마이크로몰 Y27632로 보충된 N2B27 배지 200 마이크로리터를 첨가한다. 셋째 날에 미디어 변경을 반복하십시오. 완전한 블라스토이드 형성은 넷째 날까지 일어난다.
앞서 기술한 바와 같이 블라토이드 형성을 위해 나이브 hPSC 세포 현탁액을 준비한다. 배지를 버리고, 10 마이크로몰 Y27632를 함유하는 적절한 양의 N2B27 배지를 첨가하여 배지 100 마이크로리터당 70개의 세포 밀도를 얻었다. 웰의 바닥에 세포를 클러스터링하기 위해, 플레이트를 실온에서 2분 동안 200 RCF에서 원심분리한다.
플레이트를 저산소 배양 조건 하에서 섭씨 37도에서 인큐베이션한다. 24 시간 이내에 순진한 hPSC의 응집체가 우물에서 관찰됩니다. 갓 준비하고 예열 한 PALY 배지 100 마이크로 리터를 웰에 두 번 넣으십시오.
세포 배양 플레이트를 다시 섭씨 37도의 저산소 배양기에 놓는다. 24 시간 후에 미디어의 절반을 버리고 100 마이크로 리터의 예열 된 PALY 배지로 교체하십시오. 넷째 날까지 단계를 반복하십시오.
앞서 기술한 바와 같이 대류권 형성을 위해 나이브 HPSC 세포 현탁액을 준비한다. 24시간 후에 순진한 HPSC의 응집체가 형성되면, 응집 배지를 LIF가 없는 PALY와 교환하고, 세 개의 미세몰 SC144로 보충하여 초기 트로피토배엽을 나타내는 트로피권을 형성한다. 성숙한 영양 결핍을 나타내는 트로피어를 형성하려면, 응집 배지를 PALY와 교환하고, 두 개의 미세몰 XMUMP1로 보충한다.
매일 매체를 새로 고칩니다. 완전한 트로피권 형성은 넷째 날까지 일어난다. 세포 상태를 평가하기 위해, 블라스토이드 및 트로피어스피어로부터의 전사 데이터를 이식 후 유사 인간 영양 모세포 줄기 세포를 포함하는 적절한 대조군과 비교한다.
PXGL에서 배양된 Naive hPSCs는 PALY 유도 후 48 내지 72시간 사이에 출현한 응집 및 캐비테이션 구조체였으며, 96시간 이내에 직경 150 내지 250 마이크로미터에 도달하였다. 형태학적 파라미터 및 세 계통의 존재에 기초하여, 유도 효율은 70 내지 80%에 도달하였고, 영양 영역은 유도 후 96시간 이내에 50 내지 60% 효율로 형성되었다. 블라스토이드 형성은 최적화된 유도 조건 하에서 상업적으로 이용가능한 초저 부착 96-웰 플레이트에서 성공적이었다.
단일 세포 RNA 시퀀싱 기술은 블라스토이드 세포 상태를 추가로 특성화하기 위해 사용되었다. 세포는 데이터의 클러스터링 및 시각화를 수행하는 데 사용되는 매개 변수에 관계없이 현저하게 재현 가능하게 구별되는 클러스터링 프로파일을 표시하므로 세 배반포 계통을 자신있게 구별 할 수있었습니다. 24 내지 60시간 사이에, PXGL 다능성 줄기 세포는 에피아세포와 트로피코배엽의 유사체를 형성한다.
그런 다음 60 시간에서 96 시간 사이에 극성 영양 배엽과 원시 내배엽의 유사체가 형성됩니다. 이것은 배반포 내의 사양 순서이며, 따라서 블라스토이드는 계통 사양의 발달 서열을 재구성합니다. 발발의 여러 단계에서 배아로부터 분리된 세포의 참조 데이터 세트와 블라스토이드 데이터 세트를 병합한 결과, 블라스토이드의 세포 중 97%가 배반포 세포와 함께 클러스터링되었지만 이식 후 배아의 세포와는 그렇지 않은 것으로 나타났다.
독립적 인 분석은 시간이 지남에 따라 줄기 세포가 5 일째와 7.5 일 사이에 인간 배아의 세포와 전사적으로 일치하는 세포를 형성한다는 것을 확인했다. 이것은 실제로 인간 배반포가 형성되는 발달 단계입니다. 그들은 또한 블라스토이드 내의 세포의 95 % 이상이 배반포의 세 가지 세포 계통과 일치하는 전사체를 가지고 있음을 확인했으며, 세포의 3 %는 표적을 벗어 났으며 이식 후 단계와 일치했습니다.
참고로, 우리는 초기 2D 배양이 또한 표적 세포의 약 5 %를 차지한다는 것을 관찰했다. 동등한 발달 단계는 또한 배반포 트로피 클로 배엽에 대한 CDX2 및 배반포 표피세포에 대한 PRMD14와 같은 특정 마커의 발현 패턴을 살펴봄으로써 시각화 될 수 있습니다. 초기 PXGL 배양의 품질은 절대적으로 중요하며 초기 응집체 내의 세포 수도 중요하며 MicroWells를 사용하여 제어 할 수 있습니다.
24 시간 후 세포 응집체의 전체 크기는 약 50 내지 70 마이크로미터이어야한다. 위상 완전 블라스토이드의 효율적인 형성은 인간 배아의 이식 및 이식 후 발달 과정을 연구하기위한 길을 닦고 있습니다.
