내멧은 호르몬에 응하여 매달 변경되는 조직입니다. 호르몬 불균형은 배아 부착을 방지하고 또한 암 같이 질병을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 생리적인 방법으로 여자의 바디의 외부에서 공부될 수 있도록 내메트리움을 재건합니다.
이 기술의 주요 장점은 두 개의 호르몬 반응 세포 유형, 특히 조직하고 신체에서처럼 행동하는 상피 및 기질 세포로 구성된 세포의 3D 구조를 제공한다는 것입니다. 오르가노이드는 조직 행동을 더 잘 모방 할 수 있기 때문에 결국 다른 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 자궁내막 기관지성 비만 및 다낭성 난소 증후군을 포함하여 암을 위한 현재 알려진 위험 요소의 직접적인 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
우리의 오르가노이드는 두 세포 모형 사이 파라크리노 행동의 중요성을 강조합니다. 적절한 양의 조직으로 시작하는 것이 중요합니다. 상피 및 기질 세포의 올바른 밀도를 얻는 것은 까다로울 수 있습니다.
또한 오르가노이드는 매우 작으며 IHC 염색으로 시각화하기가 어려울 수 있습니다. 이 절차의 시각화는 이 절차를 본 후 이해하기 가 훨씬 쉬울 몇 가지 단계가 있기 때문에 중요합니다. 이들은 자궁의 적당한 조직 층을 얻고, 결합할 세포의 적당한 조밀도를 얻고, 아가로즈 몰드를 종자하는 것을 포함합니다.
세포 격리를 시작하기 전에, 제조 업체의 지시에 따라 1.5 %의 아가로즈 마이크로 몰드를 주조하고 평형화하여 오르가노이드를 보관합니다. 생물 안전 캐비닛에서 무균 기술을 사용하여 섭씨 37도에서 효소 용액을 준비하고 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 용액을 15 밀리리터 원유형 튜브에 멸균하십시오. 메스를 사용하여 자궁 생검에서 자궁 내막을 긁어 내고 조직을 매우 작은 조각으로 다진다.
효소 용액을 함유한 15밀리리터 원내 튜브에 갓 다진 조직을 배치합니다. 캡을 닫고 오염을 방지하기 위해 왁스 필름으로 튜브의 상단을 감쌉니다. 튜브를 수조 또는 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에 부드럽게 흔들리며 30분간 튜브를 넣습니다.
그 후, 50 밀리리터 원내 튜브에 20 미크론 세포 스트레이너 위에 100 미크론 세포 스트레이너를 쌓습니다. 두 스트레이너를 통해 솔루션을 필터링합니다. HBSS로 15 밀리리터 원원관을 헹구고 모든 세포가 수집되도록 여과기를 통해 세척합니다.
그런 다음, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 20 미크론 세포 스트레이너를 반전하고 1 %페니실린과 연쇄 절제술로 보충 오르가노이드 미디어의 20 밀리리터와 스트레이너 떨어져 상피 세포를 씻어. 원심 분리는 500 G에서 원심 관을 5 분 동안 분리합니다. 수집된 기질 세포의 경우, 상체를 제거하고 적혈구 용해 완충제의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보펜한다.
섭씨 37도에서 10~15분간 배양하세요. 원심 분리는 5 분 동안 500 G에서 이 세포를 합니다. 상체를 제거하고 200 ~ 300 마이크로 리터의 오르가노이드 미디어로 펠릿을 다시 분리하십시오.
수집된 상피 세포의 경우, 상체세포를 제거하고 100마이크로리터의 오르가노이드 미디어에서 펠릿을 재보아보세요. 1.5%의 아가로즈 몰드가 평형화된 후, 아가로즈 몰드 의 외부에 있는 오르가노이드 배지를 제거하고 조직 배양판을 기울여 아가로즈 접시의 세포 파종실에서 배지를 신중하게 제거할 수 있도록 한다. 현미경의 밑에 상피 및 기질 세포 현탁액을 보고 현탁액에 더 많은 오르가노이드 매체를 추가하여 현탁액이 밀도에서 대략 동일하도록 한 번에 100 마이크로리터만 추가하십시오.
그런 다음 기질 세포의 한 부분을 상피 세포의 3개의 부분을 부피별로 결합합니다. 배피테 50 마이크로리터결합셀 현탁액을 아가로즈 몰드의 세포 파종 챔버로 내다. 아가로즈 금형이 세포로 채워지면 24웰 플레이트의 우물에 신선한 오르가노이드 미디어 400 마이크로리터를 조심스럽게 넣습니다.
이산화탄소 5%를 37도에 배양하여 2일마다 500마이크로리터의 오가노이드 미디어를 사용하여 배지를 변경해야 합니다. 7 일 후, 상피 및 기질 세포의 조직을 촉진 하기 위해 0.1 나노 몰러 estradiol 및 0.8 나노 몰러 테스토스테론으로 보충 되는 하나에 매체를 변경. 첫째, 끓여서 PBS에 1.5%의 아가로즈를 녹입니다.
액체 아가로오스를 뜨거운 물 비커에 넣고 약 섭씨 50도까지 식힙니다. 해부 현미경으로 24웰 플레이트를 기울이고 아가로즈 몰드 의 외부에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다. 그런 다음 유기체를 방해하지 않도록 아가로즈 몰드 의 내부에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다.
70~75마이크로리터의 따뜻한 1.5%아가로즈를 아가로즈 접시의 챔버에 조심스럽게 추가하여 오르가노이드를 방해하지 않도록 주의하십시오. 접시를 섭씨 4도에서 5분간 식힙니다. 그 후, 24웰 플레이트의 각 우물에 4%의 파라포름알데히드를 넣고 밀봉된 아가로즈 몰드 전체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정합니다.
다음 날, 파라핀 포함 을 처리 할 준비가 될 때까지 4 섭씨에 70 %에탄올에 접시를 저장합니다. RNA 격리를 시작하려면 해부 현미경으로 플레이트를 봅니다. 접시를 기울이고 아가로즈 몰드의 챔버에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다.
오가노이드가 마이크로웰에서 플러시되도록 신선한 오르가노이드 배지의 1 밀리리터를 암기로 직접 피펫하여 너무 많은 거품을 만들지 않도록 주의하십시오. 동일한 매체를 사용하여 이 강력한 파이펫 팅 프로세스를 한 번 반복합니다. 그 후, 오르가노이드를 함유하는 모든 배지를 수집한다.
500 G에서 원심분리기는 오르가노이드를 수집하고 RNA 추출을 진행한다. 이 연구에서는, 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드는 외인성 비계 물질을 사용하지 않고 생성된다. 조직학적 처리를 위해 자궁내막 오르간노이드를 함유한 아가로즈 몰드가 아가로즈로 밀봉되고, 그 다음으로 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드로 고정된다.
이러한 금형은 히스토로지, 면역형광 또는 면역히스토케작용을 위해 단면화및 염색된 표준 파라핀 포함을 위해 가공된다. 에오신 염색에 있는 헤마톡클린은 중앙에 있는 외부 및 세포를 일렬로 세우는 세포의 단 하나 층을 가진 스페로이드 같이 구조물을 제시합니다. 자궁내막, 상피 및 기질 세포를 위한 세포 특이적 마커는 중앙에 기질 세포와 함께 오르가노이드를 둘러싼 상피 세포를 드러낸다.
자궁내막 생리학의 마커는 자궁내막 유기체가 네이티브 조직의 특정 특성을 유지한다는 것을 확인합니다. 콜라겐 블루와 세포를 적색으로 얼룩지게 하는 트라이 크롬 염색은 기질 세포가 있는 중앙 내의 콜라겐의 존재를 나타내며, 토착 조직과 유사한 기질 세포에 의한 콜라겐의 활성 생산 및 분비를 입증합니다. 또한, 면역조직화학염색은 상피 세포와 기질 세포 모두에서 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체의 존재를 드러낸다.
우리가 다운스트림 실험을 위한 충분한 오르가노이드를 갖도록 세포를 조밀하게 플레이트하는 것이 중요합니다. 이것은 몇 가지 연습이 걸릴 것입니다. 자궁내막 기간구는 상이한 조건하에서 배양한 다음 면역조직화학 또는 면역형염염색과 같은 실험을 위해 수확하여 단백질 발현을 연구하거나 RNA를 위해 수확하여 유전자 발현을 연구할 수 있다.
우리의 실험실은 자궁 내막 증식 및 암으로 이끌어 낼 수 있는 변경한 호르몬 수준에 자궁 내막이 어떻게 반응하는지 조사합니다. 우리는 호르몬의 장기 치료에 대 한 이러한 organoids를 사용 하 고 다 낭 성 난 소 증후군에서 발견 하는 과잉 남성 호르몬 등 병 적인 조건을 추가할 수 있습니다., 또는 비만 유발 된 자궁 내막 변화를 공부 하는 adipocytes에서 신호. 인간 조직은 생물위험으로 간주되며 적절한 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.
