La investigación en embriones humanos está limitada por su baja disponibilidad y preocupaciones éticas, por lo que la obtención de modelos individuales que reproduzcan fielmente el desarrollo humano temprano apoyaría el progreso científico y médico. La capacidad de esta técnica para predecir el desarrollo humano depende de su capacidad para reproducir las secuencias de determinación celular de blastocistos y morfogénesis de manera efectiva, de acuerdo con la secuencia y el ritmo de desarrollo, y dicho modelado aseguraría la formación de células que realmente reflejen la etapa de blastocisto. En el futuro, los blastoides humanos pueden utilizarse para identificar dianas terapéuticas y contribuir a la modelización preclínica, por ejemplo, para mejorar un medio de fertilización in vitro o para desarrollar anticonceptivos no hormonales.
Demostrando el procedimiento estarán Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer y Giovanni Sestini. Para comenzar, prepare y precaliente los medios PXGL, los medios basales N2B27, el tampón de lavado, el PBS y los medios de agregación. Excluya los MEF de la suspensión de hPSC para formar blastoides.
Para la exclusión de MEF, prepare una placa recubierta de gelatina agregando un mililitro de gelatina al 0.1% en el pozo de una placa de seis pocillos. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 30 a 90 minutos. Para cosechar las células, retire el medio y lave las células con un milímetro de PBS.
Agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Revise las células bajo el microscopio para seguir la disociación de las colonias en células individuales. Diluya la solución de desprendimiento celular con un mililitro de tampón de lavado.
Recoja las células de la placa pipeteando suavemente de cinco a 10 veces. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Gire hacia abajo las células a 200 RCF durante cuatro minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1,5 mililitros de medio PXGL en cada pocillo. Sembra las células en las placas recubiertas de gelatina para la exclusión de MEF, e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 60 a 90 minutos. Una vez que las células naïve se siembran para la exclusión de MEF, retire el PBS de MicroWells y equilibre los pozos con 200 microlitros de medio basal N2B27 para cada chip MicroWell, e incube durante 60 minutos a 37 grados Celsius.
Recoge el sobrenadante que contiene las células ingenuas no unidas. Transfiéralo a un tubo de 15 mililitros y haga girar las células a 200 RCF durante cuatro minutos. Deseche los medios y vuelva a suspender las células en un mililitro de medios basales N2B27.
Cuente las celdas mediante diapositivas de recuento de celdas. Gire hacia abajo las células a 200 RCF durante cuatro minutos. Deseche el medio y agregue una cantidad adecuada de medios N2B27 que contengan 10 micromolares Y27632 para obtener una densidad celular de 30, 000 células por 50 microlitros.
Retire el medio de las matrices MicroWell equilibradas y agregue 25 microlitros de medios N2B27 con 10 micromolares Y27632. Agregue 50 microlitros de suspensión celular e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que las células caigan en el fondo del MicroWell. Luego agregue 125 microlitros de medio N2B27, complementados con 10 micromolares Y27632.
Dentro de las 24 horas, se observarán agregados de hPSC ingenuas en el chip MicroWell. Iniciar la formación de blastoides preparando el medio PALY. Precalentarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Retire el medio de agregación y agregue 200 microlitros de medio PALY precalentado a los MicroWells. Coloque la placa de cultivo celular de nuevo en una incubadora hipóxica a 37 grados centígrados. Repita el cambio de medios el primer día.
En el segundo día, retire el medio PALY y agregue 200 microlitros de medio N2B27, complementado con LPA y 10 micromolares Y27632. Repita el cambio de medios en el tercer día. La formación completa de blastoides ocurre en el cuarto día.
Preparar la suspensión de células hPSC ingenuas para la formación de blastoides como se describió anteriormente. Deseche el medio y agregue una cantidad adecuada de medios N2B27 que contengan 10 micromolares Y27632 para obtener la densidad celular de 70 células por cada 100 microlitros del medio. Para agrupar las células en el fondo de los pocillos, centrífuga la placa a 200 RCF durante dos minutos a temperatura ambiente.
Incubar la placa a 37 grados centígrados en condiciones de cultivo hipóxico. Dentro de las 24 horas, se observarán agregados de hPSC ingenuas en los pozos. Agregue 100 microlitros de medio PALY recién preparado y precalentado dos veces a los pozos.
Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en una incubadora hipóxica a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, deseche la mitad del medio y reemplácelo con 100 microlitros de medio PALY precalentado. Repita el paso hasta el cuarto día.
Preparar la suspensión celular HPSC ingenua para la formación de la troposfera como se describió anteriormente. Una vez que se hayan formado agregados de HPSC naïve después de 24 horas, intercambie el medio de agregación con PALY sin LIF, complementado con tres SC144 micromolares para formar trofoesferas que representen el trofoectodermo temprano. Para formar trofoesferas que representen el trofoectodermo maduro, intercambie el medio de agregación con PALY, complementado con dos micromolares XMUMP1.
Refresque el medio diariamente. La formación completa de la trofosfera ocurre en el cuarto día. Para evaluar los estados celulares, compare los datos transcriptómicos de blastoides y trofoesferas con los controles apropiados, incluidas las células madre de trofoblastos humanos similares a la implantación.
Las hPSC ingenuas cultivadas en PXGL fueron estructuras agregadas y cavitadas que surgieron entre 48 y 72 horas después de la inducción de PALY, y alcanzaron un diámetro de 150 a 250 micrómetros en 96 horas. Sobre la base de parámetros morfométricos y la presencia de los tres linajes, la eficiencia de inducción alcanzó el 70 al 80% Las trofosferas se formaron a una eficiencia del 50 al 60% dentro de las 96 horas posteriores a la inducción. La formación de blastoides tuvo éxito en placas de 96 pocillos de fijación ultra baja disponibles comercialmente en condiciones de inducción optimizadas.
La tecnología de secuenciación de ARN unicelular se utilizó para caracterizar aún más el estado de las células blastoides. Las células muestran perfiles de agrupamiento marcadamente reproduciblemente distintos, independientemente de los parámetros utilizados para realizar la agrupación y visualización de datos, lo que permitió distinguir los tres linajes de blastocistos con confianza. Entre las 24 y las 60 horas, las células madre pluripotentes PXGL forman análogos del epiblasto y del trofoectodermo.
Luego, entre 60 y 96 horas, se forman análogos del trofoectodermo polar y del endodermo primitivo. Esta es la secuencia de especificación dentro del blastocisto, por lo que los blastoides recapitulan la secuencia de desarrollo de la especificación del linaje. La fusión de conjuntos de datos de blastoides con el conjunto de datos de referencia de células aisladas de embriones en diferentes etapas de desarrollo mostró que el 97% de las células de blastoides se agruparon con las células de blastocisto, pero no con células de embriones posteriores a la implantación.
Un análisis independiente confirmó que, con el tiempo, las células madre formaron células que coincidieron transcripcionalmente con las células de embriones humanos entre el día cinco y 7.5. Esta es de hecho la etapa de desarrollo durante la cual se forma el blastocisto humano. También confirmaron que más del 95% de las células dentro de los blastoides tienen un transcriptoma que coincide con los tres linajes celulares de blastocistos, mientras que el 3% de las células estaban fuera del objetivo y coincidían con las etapas posteriores a la implantación.
Cabe destacar que observamos que nuestros cultivos 2D iniciales también comprenden aproximadamente el 5% de las células objetivo. La etapa de desarrollo equivalente también se puede visualizar observando los patrones de expresión de marcadores específicos como CDX2 para el trofoectodermo blastocisto y PRMD14 para el epiblasto blastocisto. La calidad del cultivo inicial de PXGL es absolutamente crucial, y el número de células dentro del agregado inicial también es crítico, y se puede controlar utilizando MicroWells.
El tamaño total del agregado celular después de 24 horas debe ser de aproximadamente 50 a 70 micrómetros. La formación eficiente de blastoides completos de fase está allanando el camino para estudiar los procesos de implantación y desarrollo posterior a la implantación del embrión humano.
