귀하에게 설명된 MEA 4-AP 척추 슬라이스 준비는 등쪽 경적 회로의 연결성과 척추 감각 처리 중에 이러한 네트워크가 어떻게 상호 작용하는지 연구하는 플랫폼을 제공합니다. 제시된 방법론은 등쪽 경적 회로 활동을 거시적 인 지역 해상도 수준에서 조사 할 수있게합니다. 이 준비는 척추 감각 회로에서 신호 전달을 방해하는 화합물의 능력을 평가하는 신속한 스크리닝 도구로 사용될 수 있습니다.
이 방법은 특정 세포 유형과 작은 마이크로 회로의 활동이 어떻게 많은 뉴런 집단에 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해의 격차를 해소하여 등쪽 뿔 행동 반응의 결과와 궁극적으로 통증 경험을 형성하는 데 도움이됩니다. 시작하려면 MEA를 30 분 동안 말 혈청으로 잘 채 웁니다. 혈청을 제거한 후 증류수가 거품이 없을 때까지 MEA를 증류수로 다섯 번 완전히 헹구십시오.
그런 다음 인공 CSF로 우물을 채 웁니다. 마취된 마우스를 무력화시킨 후, 엉덩이 수준에서 피부를 작게 절단하여 복부 부위 위의 피부를 제거한다. 그런 다음 모든 피부가 흉곽 케이지의 상단에서 골반 상단까지 심실 및 등쪽으로 제거 될 때까지 절단의 양쪽에있는 피부를 로스트랄로 당깁니다.
시체를 얼음 위에 놓은 후, 복부 접근법을 사용하여 내장을 제거하고 갈비뼈를 통해 흉골에 옆으로 절단하여 척추 기둥을 노출시킵니다. 견갑골과 하지와 골반의 복부 흉곽을 제거하십시오. 척추 컬럼 및 늑골 제제를 얼음 차가운 수크로오스 인공 CSF를 함유하는 해부 욕조로 옮깁니다.
허리 근육과 부착 된 위쪽 갈비뼈를 통해 핀을 배치하여 준비의 네 모서리를 모두 고정하십시오. rongeurs로 척추의 복부 표면 위에 놓인 모든 근육 및 결합 조직을 제거하고 T12-L2 척추 몸체 아래에있는 요추 - 천골 확대에 대한 척추 영역을 확인하십시오. 요추 - 천골 확대 부위에 척추 신체 꼬리를 제거하여 척추관에 앉아있는 척수에 접근하십시오.
구부러진 스프링 가위를 사용하여 척추 페디클을 양측으로 자르고 척추 몸을 로스트랄로 들어 올리고 당겨 척추의 복부와 등쪽 측면을 분리하고 척수를 노출시킵니다. 요추 - 천골 확대를 드러내기 위해 척추 시체를 제거하면 코드가 자유롭게 떠 다닐 때까지 봄 가위로 척수를 고정시키는 나머지 뿌리를 조심스럽게 제거하십시오. 요추 - 천골 확대 위와 아래의 로스트랄 및 꼬리 절단으로 척수를 분리하여 코드의 대상 부위가 자유롭게 떠 다니도록하십시오.
횡단 슬라이스의 경우, 중앙에 얕은 채널이 절단된 프리컷 폴리스티렌 블록에 부착된 경로로 요추-천골 세그먼트를 들어 올려 놓습니다. 그런 다음 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 블록 및 코드를 단면화 플랫폼에 부착하고 얼음 냉장 자당 인공 CSF 슬러리를 함유 한 절단 욕조에 놓습니다. 일단 300 마이크로미터 두께의 슬라이스가 얻어지면, 슬라이스를 산소화된 인공 CSF를 함유하는 공기 계면 인큐베이션 챔버로 옮기고 슬라이스가 실온에서 한 시간 동안 평형화되도록 한다.
등쪽 뿔 활동 기록을 시작하려면 인공 CSF로 채워진 대형 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 인큐베이터에서 MEA 웰로 슬라이스를 옮기고 추가 인공 CSF를 추가하십시오. 미세한 짧은 머리 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 60 전극 기록 어레이 위에 놓습니다. 그런 다음 가중 목을 조직 위에 올려 놓고 제자리에 고정시키고 MEA 전극과의 좋은 접촉을 촉진하십시오.
MEA를 기록 헤드 스테이지에 배치합니다. 반전 현미경을 사용하여 전극 위의 조직의 위치를 확인하여 가능한 한 많은 전극이 피상적 인 DH 아래에 있는지 확인하십시오. 적어도 두 개에서 여섯 개의 전극이 슬라이스에 닿지 않도록 하십시오. 카메라를 장치에 연결한 후 분석 중에 사용할 MEA를 기준으로 슬라이스의 참조 이미지를 촬영합니다.
그런 다음 기록 소프트웨어에서 시작 DAQ를 누르고 모든 전극이 명확한 신호를 수신하는지 확인합니다. 다음으로, 관류 입구 및 출구 라인을 인공 CSF로 채워진 MEA 웰에 부착하고 관류 시스템을 켭니다. 유속을 확인하고 유출이 수퍼 퓨세이트의 오버플로를 방지하기에 충분한지 확인하십시오.
조직을 다섯 분 동안 평형화시킨 후, 다섯 분 동안 원시 기준선 데이터를 기록한다. 관류 유입 라인을 인공 CSF에서 4-아미노피리딘 용액으로 이동시키고, 4-아미노피리딘 유도 리듬 활성이 정상 상태에 도달할 때까지 12분 동안 기다린다. 그 후, 4-아미노피리딘 유도 활성의 오분을 기록하고, 약물을 시험하거나 4-아미노피리딘의 안정성을 확인하기 위해 후속 기록을 준비한다.
각 녹음 세션이 끝나면 인공 CSF로 선을 헹구십시오. 헤드 스테이지에서 MEA를 제거하고 MEA 웰에서 그물 및 조직을 제거한 후, 인공 CSF로 MEA와 그물을 헹구고 새로운 슬라이스로 전체 과정을 반복하십시오. 분석 소프트웨어를 열고 미리 만들어진 분석 레이아웃을 로드합니다.
관심 있는 파일을 열고 참조 전극 및 과도하게 시끄러운 것으로 간주되는 전극의 선택을 취소합니다. 분석할 시간 창을 설정합니다. 그런 다음 교차 채널 필터 탭으로 이동합니다.
실험 중에 찍은 이미지와 메모를 기반으로 복잡한 참조 및 참조 전극을 선택하고 계속하기 전에 탐색을 누릅니다. EAP 필터 탭으로 이동하고 두 번째 순서 하이패스 버터워스 필터를 적용하여 LFP 활동을 제거합니다. LFP 필터 탭으로 이동하고 두 번째 순서 대역 통과 버터워스 필터를 적용하여 EAP 활동을 제거합니다.
EAP 검출기 탭에서 자동 임계값을 선택하고, 상승 및 하강 에지 박스를 체크하고, 데드 타임을 세 밀리초로 설정하십시오. 양수 및 음수 임계값을 설정하려면 원시 데이터 분석기 화면으로 돌아가 시간 마커를 이동한 다음 EAP 검출기 탭으로 돌아가 탐색을 눌러 데이터를 검사합니다. 설정된 검출 임계값이 잡음 또는 비생리적 활성을 포착하지 않고 EAP를 캡처할 때까지 이 과정을 반복한다.
LFP 검출기 탭에서 수동 임계값을 선택하고 상승 및 하강 에지 박스를 체크한 다음 데드 타임을 세 밀리초로 설정하십시오. 하나의 전극에 대한 임계값을 설정하고 충족되면 모두 적용을 선택한 다음 분석 시작을 누릅니다. 전압 게이팅된 나트륨 채널 길항제 테트로도톡신의 배쓰 적용은 EAP 및 LFP 활성을 모두 폐지하여, 이들 신호의 스파이크 의존성을 확인하였다.
4-아미노피리딘 유도 활성 파라미터의 안정성은 EAP 또는 LFP를 특징으로 하였다. LFPs에 대한 모든 활성 특성 플러스 활성의 우연의 일치는 4-아미노피리딘 적용 후 12분과 15분 후에서의 4-아미노피리딘 유도 활성의 유사성에 기초하여 안정하였다. 이 기능의 EAP 또는 LFP는 여러 전극에서 감지되는 일치 이벤트의 수가 증가하는 것이 특징입니다.
연결된 인접 전극의 수, 및 4-아미노피리딘 자극 후 상대적인 안정성에 뒤따르는 인접한 전극과 LFPs 사이의 결합의 강도. 슬라이스 배향은 시험관내 제제를 위한 중요한 고려사항이다. 4-아미노피리딘 자극은 슬라이스 배향에 관계없이 SDH에서 유사한 리듬 활성을 유도하였다.
마지막으로, DH 네트워크의 4-아미노피리딘 활성화의 관련성에 대해 추가로 밝히기 위해, 상승된 칼륨 인공 CSF 용액을 도포하고 4-아미노피리딘 자극에 대한 유사한 DH 반응을 불러일으키는 것으로 나타났다. 프로토콜의 주요 단계는 조직 준비 및 절편의 배치에 있으며, 신중을 통해 조직이 건강하다는 것을 보장하지만시기 적절하고 해부 된 MEA 상의 조직의 섬세한 최적 위치는 양질의 결과를 얻는 데 도움이됩니다.
