يوفر إعداد شريحة العمود الفقري MEA 4-AP الموصوف لك منصة لدراسة اتصال دوائر القرن الظهري وكيفية تفاعل هذه الشبكات أثناء المعالجة الحسية للعمود الفقري. تمكن المنهجية المقدمة من التحقيق في نشاط دائرة القرن الظهري على المستوى الإقليمي العياني للاستبانة. يمكن استخدام هذا المستحضر كأداة فحص سريع لتقييم قدرة المركبات على تعطيل الإشارات في الدوائر الحسية الشوكية.
تساعد هذه الطريقة على سد الفجوة في فهمنا لكيفية تأثير نشاط أنواع معينة من الخلايا والدوائر الدقيقة الصغيرة على مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية لتشكيل مخرجات استجابات سلوك القرن الظهري في نهاية المطاف تجربة الألم. للبدء ، املأ MEA جيدا بمصل الحصان لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة المصل، اشطف MEA جيدا خمس مرات بالماء المقطر حتى يصبح الماء المقطر غير رغوي.
ثم املأ البئر بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. بعد قطع رأس الفأر المخدر ، قم بإزالة الجلد فوق منطقة البطن عن طريق إجراء قطع صغير في الجلد على مستوى الوركين. ثم اسحب الجلد على جانبي القطع بشكل علوي حتى تتم إزالة الجلد بالكامل من أعلى القفص الصدري إلى أعلى الحوض ، سواء من الناحية البطنية أو الظهرية.
بعد وضع الجسم على الجليد ، استخدم نهجا بطنيا لفضح العمود الفقري عن طريق إزالة الأحشاء وقطع الأضلاع أفقيا إلى القص. قم بإزالة القفص الصدري البطني ، وكل من الكتف ، والأطراف السفلية والحوض. انقل العمود الفقري وإعداد الأضلاع إلى حمام تشريح يحتوي على السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي البارد الثلجي.
قم بتثبيت جميع الزوايا الأربع للتحضير عن طريق وضع دبابيس من خلال عضلات أسفل الظهر والأضلاع العلوية المرفقة. قم بإزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة التي تغطي السطح البطني للفقرات مع الرونور وتحديد المنطقة الفقرية فوق التوسيع القطني العجزي ، والذي يقع تقريبا تحت الأجسام الفقرية T12-L2. قم بإزالة ذيلية للجسم الفقري إلى منطقة التوسيع القطني العجزي للوصول إلى الحبل الشوكي الجالس على القناة الفقرية.
باستخدام مقص زنبركي منحني ، قم بقطع عنيقات العمود الفقري بشكل ثنائي أثناء رفع وسحب الجسم الفقري بشكل كبير لفصل الجوانب البطنية والظهرية للفقرات وفضح الحبل الشوكي. بمجرد إزالة الأجسام الفقرية للكشف عن التضخم القطني العجزي ، قم بمسح الجذور المتبقية بعناية التي تثبت الحبل الشوكي بمقص زنبركي حتى يطفو الحبل بحرية. اعزل الحبل الشوكي بجروح في السطح والذيلية فوق وأسفل التوسيع القطني العجزي لجعل المنطقة المستهدفة من الحبل تطفو بحرية.
بالنسبة للشرائح المستعرضة، ارفع الجزء القطني العجزي وضعه بواسطة مسار مرفق على كتلة بوليسترين مقطوعة مسبقا مع قناة ضحلة مقطوعة في المنتصف. ثم ، استخدم لاصق cyanoacrylate لتوصيل الكتلة والحبل بمنصة التقسيم ووضعها في حمام القطع الذي يحتوي على ملاط CSF الاصطناعي من السكروز البارد الثلجي. بمجرد الحصول على شرائح بسمك 300 ميكرومتر ، انقل الشرائح إلى غرفة حضانة واجهة الهواء التي تحتوي على CSF الاصطناعي المؤكسج واسمح للشرائح بالتوازن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
لبدء تسجيل نشاط القرن الظهري، انقل الشريحة من الحاضنة إلى بئر الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام ماصة باستور كبيرة الطرف مملوءة بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي وأضف CSF اصطناعيا إضافيا. استخدم فرشاة طلاء شعر قصيرة ناعمة لوضع الشريحة فوق صفيف تسجيل 60 قطبا. بعد ذلك، ضع رقبة مرجحة فوق الأنسجة لتثبيتها في مكانها وتعزيز الاتصال الجيد مع أقطاب MEA.
ضع MEA في مرحلة رأس التسجيل. تحقق من موضع الأنسجة فوق الأقطاب الكهربائية باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن أكبر عدد ممكن من الأقطاب الكهربائية تحت DH السطحي. تأكد من أن اثنين إلى ستة أقطاب كهربائية على الأقل لا تتصل بالشريحة. بعد توصيل الكاميرا بالجهاز، التقط صورة مرجعية للشريحة المتعلقة ب MEA لاستخدامها أثناء التحليل.
ثم اضغط على بدء DAQ في برنامج التسجيل وتأكد من أن جميع الأقطاب تتلقى إشارة واضحة. بعد ذلك ، قم بتوصيل خطوط مدخل ومخرج التروية ب MEA المملوءة جيدا ب CSF الاصطناعي وقم بتشغيل نظام التروية. تحقق من معدل التدفق وتأكد من أن التدفق الخارجي كاف لمنع تجاوز الفوسات الزائدة.
بعد موازنة الأنسجة لمدة خمس دقائق، سجل بيانات خط الأساس الخام لمدة خمس دقائق. انقل خط مدخل التروية من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي إلى محلول 4-aminopyridine وانتظر لمدة 12 دقيقة حتى يصل النشاط الإيقاعي الناجم عن 4-aminopyridine إلى حالة مستقرة. ثم ، سجل خمس دقائق من النشاط الناجم عن 4-aminopyridine وكن مستعدا للتسجيلات اللاحقة لاختبار الأدوية أو التحقق من استقرار 4-aminopyridine.
بعد كل جلسة تسجيل، اشطف الخطوط باستخدام السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. بعد إزالة MEA من مرحلة الرأس وإزالة الشبكة والأنسجة من MEA جيدا ، اشطف MEA والشبكة باستخدام CSF الاصطناعي وكرر العملية برمتها بشريحة جديدة. افتح برنامج التحليل وقم بتحميل تخطيط التحليل المصنوع مسبقا.
افتح ملف الاهتمام وقم بإلغاء تحديد القطب المرجعي وأي أقطاب كهربائية تعتبر صاخبة بشكل مفرط. قم بتعيين النافذة الزمنية للتحليل. ثم انتقل إلى علامة التبويب عامل تصفية عبر القنوات.
حدد المرجع المعقد والأقطاب الكهربائية المرجعية استنادا إلى الصورة التي تم التقاطها والملاحظات التي تم تدوينها أثناء التجربة واضغط على استكشاف قبل المتابعة. انتقل إلى علامة تبويب عامل تصفية EAP وقم بتطبيق عامل تصفية Butterworth عالي التمرير من الدرجة الثانية لإزالة نشاط LFP. انتقل إلى علامة تبويب عامل تصفية LFP وقم بتطبيق مرشح Butterworth لتمرير النطاق من الدرجة الثانية لإزالة نشاط EAP.
في علامة التبويب كاشف EAP ، تأكد من تحديد العتبة التلقائية ، ووضع علامة في مربعات الحافة الصاعدة والهابطة ، وتعيين الوقت الميت إلى ثلاثة مللي ثانية. لتعيين عتبات إيجابية وسلبية، افحص البيانات عن طريق العودة إلى شاشة محلل البيانات الأولية، وتحريك علامة الوقت، والعودة إلى علامة التبويب كاشف EAP، والضغط على استكشاف. كرر العملية حتى تلتقط عتبة الكشف المحددة EAPs دون التقاط الضوضاء أو النشاط غير الفسيولوجي.
في علامة التبويب كاشف LFP ، تأكد من تحديد العتبة اليدوية ، ووضع علامة على مربعات الحافة الصاعدة والهابطة ، وتعيين الوقت الميت إلى ثلاثة مللي ثانية. قم بتعيين عتبة لقطب واحد ، وبمجرد الرضا ، حدد تطبيق على الكل ثم اضغط على بدء التحليل. ألغى تطبيق الحمام لمضاد قناة الصوديوم المسور الجهد tetrodotoxin كل من نشاط EAP و LFP ، مما يؤكد اعتماد الارتفاع لهذه الإشارات.
تم تمييز استقرار معلمات النشاط المستحثة ب 4-aminopyridine ل EAP أو LFP. كانت جميع خصائص النشاط بالإضافة إلى تزامن النشاط ل LFPs مستقرة بناء على تشابه النشاط الناجم عن 4-aminopyridine في 12 دقيقة بعد تطبيق 4-aminopyridine وبعد 15 دقيقة. تميزت EAPs أو LFPs الخاصة بالميزة بزيادة في عدد الأحداث المتزامنة المكتشفة عبر أقطاب كهربائية متعددة.
عدد الأقطاب الكهربائية المجاورة المرتبطة، وقوة الروابط بين الأقطاب الكهربائية المجاورة وLFPs بعد تحفيز 4-aminopyridine ثم الاستقرار النسبي. اتجاه الشريحة هو اعتبار مهم للاستعدادات في المختبر. حفز 4-أمينوبيريدين نشاطا إيقاعيا مشابها في SDH بغض النظر عن اتجاه الشريحة.
أخيرا ، لإلقاء مزيد من الضوء على أهمية تنشيط 4-aminopyridine لشبكات DH ، تم تطبيق محلول CSF اصطناعي مرتفع للبوتاسيوم وأظهر أنه يثير استجابة DH مماثلة لتحفيز 4-aminopyridine. الخطوات الرئيسية في البروتوكول هي في إعداد الأنسجة ووضع الأقسام، وضمان الأنسجة صحية من خلال تشريح دقيق، ولكن في الوقت المناسب، فضلا عن تحديد المواقع المثلى الدقيقة للأنسجة على MEA سيساعد في الحصول على نتائج جيدة.
