제 이름은 Jarlath Nally이며, 저는 아이오와 주 에임스국립동물질병센터에서 연구팀의 일원이며 렙토스피로증을 연구하고 있습니다. 렙토스피로증은 소홀히 한 질병입니다. 그것은 세계적인 질병입니다.
그리고 정말, 우리는 박테리아의 이 독특한 단이 감염을 일으키는 원인이 되는 방법의 아주 제한적인 이해가 있습니다. 따라서 오늘의 프리젠 테이션은 CRISPR 간섭이라는 기술을 사용하여 렙토스피라에 의해 표현 된 특정 유전자를 특별히 침묵시킴으로써 렙토스피라증의 병원성 메커니즘의 평가를 용이하게하기 위해 사용할 수있는 새로운 도구에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 그러나 뉴턴 콜로니를 선택하는 능력은 이러한 까다로운 렙토스피라에 가장 적합한 성장 매체를 제공하는 데 매우 의존합니다.
그래서, 우선, 우리는 릭 혼즈비당신을 소개할 거야, 누가 매우 간단하게 이러한 까다로운 박테리아를 전파하는 새로운 미디어를 소개했다. 그리고 우리는 leptospira 내의 표적 유전자를 침묵하는 CRISPR 간섭 방법론에 대해 이야기 할 루이 페르난데스를 소개합니다. 안녕하세요, 저는 릭 혼즈비입니다.
100여 년 전 아나다에 의한 신원 확인 이후, 렙토스피라는 일반적으로 환경이나 포유류 숙주 체온을 반영하는 온도인 섭씨 29도에서 고립되고 전파되었습니다. 10 년 전, USDA ERS는 렙토스피라 미디어에 대한 개선을 연구하기 시작했고이 연구에서 혼즈비 - 알트 - 날리 미디어가 개발되었습니다. 이 매체를 사용하여 임상의와 연구자들은 포유류 호스트를 보다 밀접하게 모방하는 온도와 환경에서 현장 사례및 체외 연구에서 렙토스피라를 보다 신속하게 격리하고 전파할 수 있었습니다.
우리는 이 매체를 계속 최적화하고 있습니다, 그러나 의미하는 바와 같이, HAN은 시험관 내 연구에서 수의및 인간 임상 적 고립을 현저하게 개선하고 렙토스피라증 예방을위한 보다 효과적인 백신의 개발을 입증했습니다. 안녕하세요, 저는 루이스 페르난데스입니다. 지금까지 렙토스피로증의 발병은 주로 유전 튜브를 효과적이고 쉽게 수행하기 가 부족하기 때문에 탐구되지 않았습니다.
여기에서 CRISPR 간섭 또는 CRISPRi라는 새로운 기술을 설명합니다. 그리고 이 기술은 우리가 단지 2개의 분대, 죽은 Cas9에게 불린 1개의 DNA 결합 단백질, 및 단하나 가이드 RNA에게 불린 키메라 RNA 분자를 표현할 필요가 있기 때문에 아주 간단합니다. 그리고 복잡한 dCas9 및 가이드 RNA는 우리의 표적 유전자에 베이스 페어링을 만들고 그러므로 전사를 감소또는 차단할 것입니다.
또한 새로 설명된 HAN 미디어를 사용하여 돌연변이 회복을 위한 식민지 형성 시간을 대폭 단축할 수 있습니다. 첫 번째 단계는 가이드 RNA에 포함 될 프로토 스페이서를 정의하는 것입니다. 이러한 서열은 원하는 유전자 표적에 대한 염기 페어링을 정의하는 20개의 뉴클레오티드를 포함한다.
연쇄상 구균 pyogenes, Cas9 및 프로토 스페이서 인접 모티프, NGG에 대해 정의된 매개 변수를 사용하여 웹 서버 CHOPCHOP에 뉴클레오티드 서열을 제출한다. 결과에 따라 마이너스 추세 내에서 가장 좋은 점수를 가진 프로토 스페이서를 선택합니다. NGG 모티프는 최종 순서에 포함되지 않습니다.
우리는 단일 가이드 RNA를 표현하기 위한 lipL32 프로모터를 사용하고 있으며, 이는 보존된 dCas9 스캐폴드에서 5-prime에서 변수 20 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 카세트를 얻은 후 PMaOri로 강등됩니다. xma1 제한 사이트에서 dCas9 플라스미드.
컨쥬게이션용 렙토스피라 세포는 HAN 미디어에서 섭씨 29도 또는 37도에서 재배된다. 양해하기 하루 전에, 기증자 균등세포는 이아미노피멜산, DAP 및 스펙티노마이신으로 보충된 LB 매체에서 재배됩니다. 다음으로, 컨쥬게이션 그릴의 날에는 LB 플러스 DAP의 포화 된 대장균 배양.
바이오 안전 후드 내부에는 멤브레인 필터를 유리 베이스 위에 배치한 다음 15ML 유리 깔때기를 사용하여 여과 장치를 조립했습니다. 두 조각은 이 스프링 클램프로 함께 개최됩니다. 그런 다음 유리를 진공 펌프에 연결하고 5 ML의 렙토스피라 배양을 깔때기에 추가합니다.
다음으로, 관심의 플라스미드를 포함하는 E.Coli 베타 2163 균주를 추가합니다. 부피는 배양의 광학 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 일대일 세포 파이퍼시온을 목표로하고 있습니다.
진공 펌프를 돌려, 지금 액체우리는 멤브레인을 통해 얻을 것이다 및 세포는 그것의 상단에 집중됩니다. 필터를 가지고 EMJH 플레이트 플러스 DAP, 이중 에 사이드업에 배치합니다. 24시간 동안 섭씨 29도에서 플레이트를 배양합니다.
그런 다음 플레이트에서 필터를 복구하고 50 ML 원전 튜브에 배치합니다. 액체 HAN 매체 1ML을 사용하여 파이펫팅을 통해 필터에서 세포를 복구합니다. 암장 현미경 검사법에 의해 복구된 세포를 시각화합니다.
이 단계에서 E.coli및 렙토스피라의 동등한 숫자를 볼 수 있습니다. 100~200마이크로리터는 스펙티노마이신을 함유한 HAN 플레이트에 박테리아를 퍼뜨리는 데 사용된다. 이 단계에서 DAP는 생략되고 대장균은 증가하지 않습니다.
플레이트는 섭씨 37도, CO2 3%로 배양됩니다. 식민지는 8 일에서 10 일 사이에 명백해야합니다. 렙토스피라 심문식민지는 시각화하기가 조금 까다롭습니다.
여기서 우리는 자란 식민지를 쉽게 볼 수 있도록 보여주고 있습니다. 돌연변이를 복구하기 위해 1.5 ML 튜브에 액체 HAN 100 마이크로리터를 추가합니다. 각 플레이트에서 적어도 3개의 식민지를 섭취하는 것이 좋습니다.
파이펫 팁을 사용하여 개별 콜로니를 플레이트에서 검색합니다. 애거는 혼자 촬영 될 것으로 예상된다. 식민지는 MTP PMaOri를 포함하는 제어 판에서 가져와야합니다.
dCas9 플라스미드. 및 dCas9와 함께 플라스미드를 함유하는 렙토스피라를 함유한 플레이트및 표적 유전자를 위해 설계된 가이드 RNA. 복구된 세포는 이제 암장 현미경 검사의 밑에 시각화될 수 있고 가능한 leptospiras의 존재를 확인합니다.
레프토스피라를 시각화한 후, 스펙티노마이신을 함유한 액체 HAN 매체로 세포를 이송한다. 배양 성장 후, 세포는 이제 침묵 확인 및 표현형 평가를 위해 복구될 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체가 유효한 경우 면역블롯은 침묵을 평가하는 직선 전진 방법론이다.
pMAOri를 포함하는 렙토스피라. dCas9 단독으로 또는 가이드 RNA Cas와 함께 PCR, 목재 측면 프라이머에 의해 평가됩니다. DMT 플라스미드는 약 300개의 베이스 쌍의 대역을 초래하고 가이드 RNA 카세트가 존재할 때 약 700의 유일한 종류를 달성하게 됩니다.
전세포 추출물을 이용한 면역블롯은 침묵 확인을 위해 수행되며, lipL32 단백질 발현은 dCas9로 발현된 플라스미드를 함유하는 세포에서 폐지되고 이 유전자를 표적으로 하는 RNA를 안내한다. 그리고 링크 A와 링크 B모두 가이드 RNA를 포함하는 세포에서 결석하고, 두 유전자모두에 대해 특이하다. 컨트롤 lipL41은 모든 차선에서 볼 수 있습니다.
그래서 우리는 렙토스피라 심문관에 CRISPR 간섭을 사용했습니다, 우리는 또한 렙토스피라의 몇몇 추가 병원성 종에 그것을 이용했습니다. 우리는 특정 유전자를 침묵뿐만 아니라 작은 비 코딩 RNA의 표현을 침묵하는 데 사용했습니다. 우리의 연구 관심은 감염의 병원성 메커니즘을 이해하는 데 있으므로 일반적으로 분산 요인을 식별하기 위해 보이지만 분명히 자신의 선택 유전자와 자신의 연구 영역에 따라 침묵 할 수 있습니다.
그리고 예를 들어, 그것은 운동성 또는 렙토스피라가 환경에서 지속되는 방법, 또는 신진 대사를 이해하는 것일 지도 모릅니다. 어쨌든, 기능성 유전체학을 수행하고 문제의 유전자의 생물학적 중요성을 이해할 수 있는 특정 돌연변이를 생성할 수 있어야 합니다. 그래서 국립 동물 질병 센터에서 여기 우리 모두에서, 우리는 당신에게 당신의 연구와 행운의 최선을 기원합니다.
