이 작품은 R01MH097949을 부여 NINH에서 지원하고, 자폐증은 BWL와 노리스 코튼 암 센터의 광학 이미징 공유 계측 그랜트 P30CA023108에 파일럿 그랜트 7359을 말한다.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

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성공적인 바이러스 성 포장에 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 비정상 세포가 크게 발생 바이러스의 양을 감소하므로 셀 상태는 이전과 트랜시 중요하다. 형질 포장이 성공적이라면, 셀의 100 %가 형광을 표현해야하고, 세포는 기능 syncytium을 형성한다. 단계 3.2.4 튜브를 탭하면 효율적 고역가 형질 전환에 필요하고, HEPES 완충 생리 식염수의 pH가 정확해야한다. 바이러스 성 포장에 필요한 플라스미드를 생산하는 맥시 준비합니다 매우 순수해야합니다. 이 점, 상기 최종 용출 DNA를 침전시키고 에탄올 트리스 EDTA 버퍼에 일시 중지 다시 유용하다. 이는 카페인이 바이러스 컬렉션 전날 6 (스텝 3.4)에 첨가되어있는 배지에서 2 % 이하로하는 혈청의 양을 줄이기 위해 매우 중요하다. 혈청이 감소되지 않은 경우, 최종 정제 된 바이러스 혈청 PROT의 바람직하지 않은 양을 포함EIN. 폴리에틸렌 글리콜 바이러스 입자를 침전 6000의 사용은 초 원심 분리의 필요성을 제외한다. Cas9의 CRISPR 포함 된 바이러스는 일반적으로 단독으로 형광을 포함하는 바이러스보다 배 이하 (10) 주변의 역가를 참고하는 것도 중요합니다. 정위 수술 흡입 마취제의 사용은 주 사용 마취제에 비해 신속하고 정확한 제어 또는 동물의 의식을 허용하고 큰 연령대 통해 마취를 허용한다. 깨끗하고 무균 수술 악기를 유지하는 것이 매우 중요하며, 재생 가능한 타겟팅은 머리의 정확한 위치를 필요로한다. 정위 악기와 두개골이 제자리에 단단히 느낌이 머리의 어떤 피칭 또는 롤링이없는 것을 확인합니다. 또한 두개골의 정위 좌표를 결정하는 봉합사를 찾기 위해 건조되도록하는 것이 유용 할 수있다. 또한, 정위 좌표 각각에 대해 레이트 및 부피는 경험적으로 결정되어야한다. 이 기술은 (AAVs) .Therefore 아데노 - 관련 바이러스에 비해 때 렌티 또는 레트로 바이러스의 확산이 특히 제한되는 이산 뇌 영역에 감염 될 때, 이러한 바이러스는 가치가 있지만, 전체 감염 AAVs과 연관되지 않은 것을 제한하고 동물 행동 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜 카페인의 사용은 크게 이러한 바이러스의 역가를 증가 시키지만 여전히 AAV 포장에서 얻어지는 적정량만큼 높지 않다. 또한, 일시적으로 형질 때 CRISPR / Cas9 안정 게놈 편집도 형성으로 안정적인 통합 형광 발현의 장점이 있고이 가능하다 진행중인 결국 목표 효과를 생성 할 수있다 Cas9 및 sgRNA의 발현을. AAVs와 CRISPR / Cas9 시스템은 세포 분열에 전파되는 게놈 변화를 생성하기에 충분한 과도 발현은, 그러나, 형광 발현이 유지되지 않을 것이다. 렌의 창조ti- 및 CRISPR / Cas9 체계를 이용하여 레트로 바이러스는 다양한 유기체의 모든 신규 유전자를 타겟팅하는 능력을 부여한다. 유전자 편집의 효율 Cas9 절단 타겟팅 가이드 RNA의 순서에 의존 할 것으로 보인다. 경험적으로 시퀀싱 Neuro2A 세포를 감염 후 10 % 내지 클론의 80 %가 삽입과 삭제를 포함하는 것으로 결정되었다. Neuro2A 세포에서 산출 INDEL 주파수 뉴런에서 그들의 반사 여부 현재 알려져 있지 않다. 이러한 Benchling 같은 안내 RNA 디자인 소프트웨어는 주어진 표적 서열의 효율을 예측할 수있다 「온 대상 &quot;점수를 포함한다. 예 : &quot;온 대상&quot;점수가 더 광범위하게 구현된다 경험적으로 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 신경 세포와 다른 세포 유형으로 결정되는 신뢰할 수있는 요구에 어떤 정도. 렌티 바이러스 기반의 형질 전환 동물 생산은 렌티 바이러스-전달 유전자는 경기도가 있다는 보고서를 가변적으로 성공했다11 lenced. DNA의 CRISPR 매개 유전자 편집 전체 동물 모델을 생성하기 위해 세균 라인을 통해 전달 될 수있다. 따라서, 안정적인 게놈 편집 바이러스-전달 형광체 및 Cas9의 유전자의 침묵에도 불구하고 달성 할 수있다. 이 대상으로 게놈 변경에 대한 효율적인 플랫폼을 제공 할 수있다. CRISPR / Cas9 시스템의 바이러스 전달, 트랜스 제닉 생물을 요구하지 않는 반면, 이들 기술들에 상보 적이다. 예를 들어, inducibly 유전자 조작과 신경 활동 사이의 관계에 복잡한 연구를 촉진한다 Cre 호텔과 Cre 호텔 의존 opto- 또는 화학 - 유전 형질 전환 유전자를 발현하는 화합물 형질 전환 동물에 이러한 바이러스 입자를 주입. 두 번째 예는 유전자 - 유전자 상호 작용을 선별하기위한 시도 조건부 녹아웃에이 Cas9 / sgRNA 바이러스 입자를 제공하는 것입니다. 마지막으로,이 연구의 또 다른 흥미로운 경로는 환자 유래 세포의 표현형 및 치료 화합물의 선별,하는 수이다확인하고 다양한 질환 파쇄 유전자 네트워크를 탐색하는데 사용될 수.

정상적인 생리 질환 병리의 기초 연구를 정밀 모델 유기체에서 유전자 발현을 조작 할 필요가있다. 관심있는 유전 요소는 재조합 효소 인식 부위와 측면으로 접하고, 상기 포유 동물 모형 유기체이 크게 제작 및 형질 전환 마우스의 개발에 집중되어있다. 이것은 이러한 측면 유전자의 사이트 특정 조작 될 수 있습니다. 이 성공적인 전략되었지만, 시간 및 리소스 집약적이고; 예를 들어, floxed 유전자 Cre 호텔의 재조합 효소 및 Cre 호텔 리포터 유전자를 발현 것 트리플 형질 전환 동물을 만드는 것은 여러 교배 및 검증을 필요로한다. 대조적으로, 복제의 정위 주사는 floxed 유전자 동물에 형광 단백질 및 재조합 효소를 코딩하는 결함 바이러스 입자는 복합 유전형 또는 사육 한 전략을 필요로하지 않는다. 바이러스 발현 형광 단백질 및 Cre 호텔 경우 또한, 제 ENCO 바이러스와 공동 주입딩 다​​른 형광 단백질, 이것은 표적 유전자 조작을위한 내부 - 조직 제어를 제공한다. 이 전략은 여전히​​ 녹아웃 동물의 사용을 필요로하지만, 급속도로 매개되는 RNA 기반 전략은 형질 전환 동물에 대한 필요성을 회피. 예를 들어, 형광 단백질과 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를)를 인코딩 복제 결핍 바이러스의 정위 주사는 관심의 유전자의 전사의 강력한 감소가 발생하는 세포의 내생의 RNAi 기계를 사용할 수 있습니다. 그러나, shRNA를 전략은 종종 겸손 세포의 표현형이 발생 미묘한 유전자 노크 다운을 생산하고 있습니다. 노크 다운 더 생리 학적 이형 유전자 장애에 대한 관련 될 수 있지만, 그 감소 견고성이 노크 아웃에 비해이 새로운 유전자의 표현형 발견에 적합하지 않습니다. 최근에 등장했습니다 세 번째 기술 관련 CRISPR-(정기적으로 Interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 클러스터)를 CRISPR / Cas9은 (단백질 9) 시스템은, 작은 외래 RNA 및 DNA 절단 효소의 발현 양에 의존한다. CRISPR / Cas9 시스템은 외국 식별 바이러스로부터 DNA를 침입하고 Cas9 효소 3,4를 통해 열화를 대상으로하는 방법을 진화 원핵 면역 시스템에서 적응했다. 이 강력한 게놈 편집 기술은 표적 결실, 삽입 및 돌연변이를 만드는 데 사용될 수있다; 다음과 같은 프로토콜은 생체 내에서 발현을 녹아웃하기 위해 관심의 유전자에 삭제를하는 방법을 간략하게 설명합니다. Cas9 효소는 발판 RNA와 관심 영역에 상동과 인접 가이드 RNA로 표현해야합니다. 이 기술을 이용하여 유전자의 녹아웃 합성 RNA를 가이드 (sgRNA)를 사용하여 게놈의 특정 영역에 Cas9 타겟팅 및 관심 부위에서 이중 가닥 나누기 (DSBs)을 유발 요구한다. 이 DSBs 후 비 동종 최종 합류 (NHEJ)하는 제작을 통해 내생 세포 수리 기계 수리된다과오 또는 넌센스 돌연변이를 생성 할 수 있으므로 기능성 단백질 식 (5)의 손실을 만들 수 있습니다 삽입과 삭제에 광고. 본 시스템은 게놈 변경을 생성하기 때문에, 단지 Cas9 및 sgRNA의 일시적인 발현을 필요로한다. 안정 형광 표시기가 이와 같이 조작 된 세포 및 그 자손을 식별하기 위해 그러나 바람직하다. 레트로 바이러스 및 렌티 안정적으로 장기간의 발현 및 유사 분열 동안 유지 딸세포까지 전달되는 숙주 세포에 관심 DNA를 통합하는 이점을 갖는다. 이 프로토콜 설계 및 결함 복제 고역가 레트로 바이러스의 두 종류의 생산을 설명 인간 면역 결핍 바이러스 유래의 렌티 바이러스 입자 (렌티)과 말로 뮤린 백혈병 바이러스 (레트로 바이러스)에 기초하여 이들. 이러한 바이러스의 양이 안정한 큰 유전자의 발현을 지원할 수 있지만, 레트로 바이러스 입자는 게놈 내로 통합 할 수 뒤따라서 핵 봉투의 저하와 함께 반지 세포 분열은 레이블을 도구 및 출생 날짜 셀 (6)로 사용할 수 있습니다. 렌티 바이러스는 바이러스를 수집하는 동안 카페인 (8)의 사용을 포함하여 상대적으로 낮은 역가 7,이 방법론 인 명성을 가지고 있지만, 통상적으로 10 9 10 10 입자 / ml의의 역가를 생성합니다. 렌티 및 레트로 바이러스의 또 다른 이점은 매우 큰 인서트에 대한 내성이다. 다음 프로토콜 모음 형광 리포터는 sgRNAs 및 Cas9은 DNA를 변경뿐만 아니라 형광 단백질을 발현하는 CRISPR / Cas9 시스템을 이용하는 코딩하는 렌티을 설계 또는 레트로 바이러스에 대한 절차를 설명. 마우스 정위 신경 외과는 형태, 기능, 감염된 신경 세포의 연결을 연구하기 위해 생체 내에서 바이러스를 주입하기위한 유용한 방법이다. 신경 세포의 바이러스 감염이 팀 장기간에 걸쳐 발현을 조작하기 위해 사용될 수있다이러한 개발에 걸쳐 같은 즉, 표현은 정확하게 다양한 약물 유도 시스템 및 특정 Cre 호텔 구동 식의 사용에 의해 제어 될 수있다. 이 특정 프로토콜은 성인 쥐의 뇌에 대한 관심의 유전자를 녹아웃하는 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 주입하는 방법에 대해 설명합니다. 마우스는 48 시간 후 분사 내에서 볼 수있는 바이러스 성 유전자의 절차와 표현에서 매우 신속하게 복구 할 수 있습니다. 그러나, 형광 발현 3 주 후 감염에 의해 근처 최대 수준의 결과 주간의 과정을 통해 증가가 나타납니다. 바이러스 정위 주사를 거쳐 마우스 동작, 전기 생리학 또는 형태 학적 연구에 사용할 수있다. 전반적으로, 이러한 절차의 목적은 정위 수술 특정 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 사용하여 성인 마우스 뇌 유전자 녹아웃 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;List of Cell Culture Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>293FT cell line</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>For Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP cell line</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>For Retrovirus</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modification of DMEM (IMDM)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&amp;nbsp; 1% P/S</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 10&amp;nbsp;cm plate</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;List of Transfection Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5&amp;nbsp;ml polystyrene tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Make a 2.5 M solution in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES Buffered Saline (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95&amp;nbsp;g HEPES, 0.106 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.01 (exact!)</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;M syringe filter unit</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;M syringe filter unit</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>60 cc L/L Syringe</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>polyethylene glycol&amp;nbsp;&amp;nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Donor Horse Serum</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Stereotaxic Surgery Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>artificial tear ointment</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>normal saline&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>cotton tipped applicators</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&amp;reg; Needles Soft Pack 25 g x 5/8&quot;</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 silk sutures</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

특정 시퀀스를 대상으로 올리고 하류 hU6 프로모터의 PXL 클로닝 벡터에 삽입하고, 발현 벡터는 BbsI 복제 사이트를 사용하여 가이드 RNA 지지체의 하류에있다 &quot;CRISPR / Cas9 레트로 바이러스에 대한 가이드 스트랜드 (sgRNA)를 설계하기위한 프로토콜의&quot;다음 (그림 1, 단계 1). 이 sgRNA 다음 PXL로부터 절단하고 BstBI 및 PACI 위치 (도 1, 단계 2)를 사용하여 pRubi 백본에 삽입된다. 마지막으로, 다른 sgRNA이 유전자의 또 다른 영역을 대상으로하고 NHEJ 통해 녹아웃 가능성을 증가 pRubi-Guide1 (도 1, 단계 3)에서 제 1 가이드의 하류에 배치 될 수 PXL로 클로닝. 정확한 구문 검증은 서열 분석에 의해 결정되어야한다. 이 구조가 만들어지면, 그것은 &quot;/ 역 렌티 바이러스 생산 - CaPO4 메소드 프로토콜&quot;다음 바이러스로 패키지 될 수있다. 성공적인 패키징은 V 역가를 위하여 HEK293 세포로의 바이러스 감염에 의해 확인irus. 더 형광 발현이없는 경우, 아마도 바이러스 포장 중에 오류가 있었다. 그림 2는 2 레트로 바이러스, 하나의 표현 GFP 다른 표현 mCherry의 대표 결과, (7 일짜리) 신생아 마우스의 치아 이랑에 공동 주입 및 이십일일에게 주입 후 몇 군데. mCherry 또는 GFP와 신경 세포의 표지는 단독으로 형광을 표현하는 하나의 바이러스가 CRISPR을 표현할 수 같은 조직에서 다양한 유전자 조작의 형태 학적 평가 / Cas9 매개 KO 다른 제어 바이러스를 할 수 있습니다. 정위 주입은 의도 된 좌표의 치아 이랑의 개별 감염에 의해 입증 된 바와 같이 정확한 해부학 적 선택을 할 수 있습니다. 감염 뇌 부분을 분석 할 때, 정확한 해부학 적 부위 감염되었다고 결정될 때까지 주변 조직을 유지하는 것이 중요하다. 감염의 징후가 없다면, 주입 인접 영역 발생 가능성이D는 주변 부분에서 식별 될 수있다. 또한 정확한 주입 영역을 찾기 위해 바늘 트랙을 찾는 것이 도움이 될 수있다. 생체 내 주입, 전체 치아 이랑 함께 주동이 / 꼬리 축 감염 세포를 따라 확산하는 경향이 때 3D 재구성 (그림 3)에 의해 분석으로 VSVG의 pseudotyped 바이러스는 거의 이가있는 이랑의 여백 밖으로 확산되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> 그림 1 :. 레트로 바이러스 pRubi-Guide1 - Guide2-CRISPR 플라스미드에 대한 복제 전략이 전략은 FU 기반 렌티 바이러스 플라스미드 동일합니다. sgRNA 올리고는 어닐링과 BsbI 복제 사이트를 사용하여 PXL에 삽입됩니다. 순서는 sgRNA가 성공적으로 PXL에 삽입되도록 한 후, BstBI 및 PACI와 플라스미드를 소화. (블랙 박스) 탈락되는 삽입 한 후 바이러스 다시 B로 복제됩니다하나 pRubi - Guide1 CRISPR를 (검은 색 점선). 두번째 sgRNA 또한 PXL 삽입 및 PACI 효소를 사용하여 분해 될 수있다. 이것은 다음 PACI 사이트를 사용하여 pRubi-Guide1의 CRISPR 벡터 (빨간 점선)에 복제됩니다. 생성 된 플라스미드는 가이드 가닥뿐만 아니라 필요한 바이러스 성 요소, 프로모터 및 형광 모두 포함되어 있습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> 그림 2 :. mCherry (빨간색) 또는 GFP (녹색)를 발현하는 마우스 치아 이랑의 레트로 바이러스 주입 레트로 바이러스는 P7 마우스의 치아 이랑에 주입 하였다. 이십일일 나중에 마우스를 관류하고 뇌 단면 및 GFP 및 mCherry에 대한 염색 하였다. (A) 5 배 넓은 필드 형광 이미지는 홍보를 보여줍니다이가 이랑 주입 ecision 및 라벨 치아 이랑의 과립 신경 세포의 특이성. 해마의 형태는 DAPI (블루) 염색을 통해 알 수있다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. (B) 10 배 넓은 필드 형광 화상이 고역가 렌티 바이러스는 그 형태 형광 발현을 통해 액세스 할 수있는 다수의 셀을 감염 것을 보여준다. 스케일 바는 100 μm의를 측정한다. GFP 또는 mCherry을 표현 (C) 바이러스는 치아 이랑에 공동 주입 하였다. 레트로 바이러스의 시스템을 사용하여, 하나는 GFP 및 mCherry로 표시된 다른 조작에 의해 표시된 하나의 유전자 조작을 한 바이러스를 사용하고, 각 인한 바이러스 단일 또는 첨가제 변화를 평가할 수있다. 스케일 바는 10 μm의를 측정한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> 그림 3 :. 렌티 바이러스 주입의 해부학 적 확산 정위 공사 출<html> GFP-shPten 바이러스 및 성인의 두뇌로의 mCherry 제어 바이러스의 PTEN에 loxP / + 마우스 해마의 치아 이랑의 전체 주동이 / 꼬리 축을 따라 바이러스 확산의 결과. 이것은 바이러스의 확산 윤곽 재구성 소프트웨어를 사용하여 21 직렬 섹션 (Z = 50 ㎛의 / 제)를 통해 추적 하였다 폐쇄되는 주입의 범위의 3D 재구성에 나타낸다. 윤곽 트레이싱은 다음 볼륨 정량의 3D 이미지를 생성하기 위해 정렬했다. 전체 바이러스의 확산은 녹색으로 표시됩니다 (볼륨 = 54730800 μm의 3) 이가 지역화 확산은 (= 27,275,200 μm의 3 볼륨) 보라색에 표시됩니다. 바이러스는 니들 트랙 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 입쪽 / 꼬리 축 충전 이외에 니들 트랙 교차 뇌량 따라 퍼진다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. 레 / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; 보충 비디오 sgRNAs 1. 디자인은 레트로 바이러스와 렌티 바이러스 백본으로 복제합니다. 이 합성 가이드 RNA (sgRNA) 디자인 예제에서는 마우스 CHD8의 게놈 서열은 NCBI에서 다운로드됩니다. 개시 코돈 및 엑손 구조이어서 벡터 NTI 시각화된다. 이것은 우리가 제 1 코딩 엑손 주변의 게놈 영역을 복사 Benchling으로이 순서를 입력 할 수 있습니다. Benchling은 우리 지역의 모든 잠재적 sgRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 또한, 우리가 입력이 게놈 영역을 표시 한 후, Benchling은 우리에게 각 가이드 RNA의 대상 및 오프 목표 점수를 표시합니다. 사용자는 다음 가장 높은 온 - 오프 목표 점수 가이드 RNA를 선택할 수 있습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.5K 조회수.  Geisel School of Medicine at Dartmouth College.  CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다. 

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

행동분석학

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

면역학 및 감염병학

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

유전학

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Retrobulbar 주입 기법을 사용한 마우스의 효과적인 전신 전달

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for systemic delivery with fewer limitations. First, tail vein injections (TVIs) are limited to adult mice where the size of the tail vein is suitable for access. Being restricted to treating adult mice can be problematic when dealing with mouse models that do not survive to adulthood. Second, TVIs are not feasible for mouse models with growth retardation phenotypes where the mice never achieve the size of adult wildtype mice. Therefore, retrobulbar injections can be successfully used to treat both young and small adult mice. Lastly, retrobulbar injections are performed under anesthesia, which is less stressful on the mice than TVIs that are commonly performed without anesthesia. This article presents a protocol and detailed instructions for retrobulbar injections that can be used for systemic delivery to small and young mice.

저자 스포트라이트: 쥐 모델에서 후불 주사를 통한 유기산혈증 유전자 치료의 과제 극복

This article provides a protocol and an accompanying video for the retrobulbar sinus injection of up to a total volume of 150 &#181;L for postnatal, juvenile, and runted adult mice. This procedure is particularly well suited for the injection of small mice (15 g) when tail vein injection is not feasible.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

요약

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손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

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이 비디오의 챕터

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

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